研究背景慢性荨麻疹(Chronic urticaria,CU)是一类皮肤科常见疾病,临床症状表现为全身或局部反复发作的风团伴瘙痒,病程常持续6周以上。其致病因素常复杂且隐匿,临床上将大多数无明显外部致病因素的慢性荨麻疹患者(>80%)划归为慢性自发性荨麻疹(Chronic spontaneous urticaria,CSU)。近年来,很多研究数据表明,CSU患者人群常伴有高的幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)感染率,并且经规范的抗幽门螺杆菌治疗后,大部分患者荨麻疹症状可得到有效缓解,这也揭示了幽门螺杆菌感染和CSU发病有密切相关性。普遍认为,荨麻疹发病机制的始动环节是肥大细胞的异常激活,而此事件中肥大细胞的活化,常常是由其细胞膜上的高亲和力FcεRI受体和IgE(Immunoglobulin E)抗体病理性交联触发。尽管已有研究在个别CU病例中检测出血清特异性抗幽门螺杆菌IgE抗体,但由于感染幽门螺杆菌后引起机体的Th1(T-helper type 1,Th1)型免疫反应常优于Th2(T-helper type 1,Th2)型免疫反应,并且这些病例中检测出的血清特异性抗幽门螺杆菌Ig E抗体处于低滴度水平,这都提示Ig E介导的肥大细胞活化效应不是幽门螺杆菌相关性荨麻疹的主要致病机制。鉴于肥大细胞膜上存在多种正性调节受体,除了对Ig E抗体高亲和力的FcεRI受体外,低亲和力的Ig G受体、循环免疫复合物受体、补体受体或Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)等的特异性结合也可能导致肥大细胞的活化。有个别研究指出,在伴幽门螺杆菌感染的CU患者血清中,可以检测出高水平的特异性抗幽门螺杆菌或其脂蛋白Lpp20的IgA和IgG抗体,但针对大样本的CSU患者血清中抗幽门螺杆菌及其蛋白成分抗体水平的调研鲜有报道,细菌特异性抗体与CSU发病的相关性及可能机制有待进一步验证和明确。尽管某些研究显示,幽门螺杆菌不能直接激活大鼠的肥大细胞,但这种直接激活效应并未在人的肥大细胞上得到评估。虽然近年来一些研究表明,某些幽门螺杆菌蛋白如空泡毒素(Vacuolating cytotoxin A,VacA)和中性粒细胞激活蛋白(neutrophil-activatingprotein,nap),能够直接激活肥大细胞,这提示幽门螺杆菌极有可能通过直接作用的方式激活肥大细胞,参与cu的病程,但目前的相关研究仍停留在极个别蛋白与肥大细胞作用水平,幽门螺杆菌对肥大细胞的激活作用尚缺乏系统性的分析和研究。目的1.探讨幽门螺杆菌感染和csu发病是否存在相关性;2.检测csu病例血清中抗幽门螺杆菌全菌抗原及其lpp20脂蛋白特异性ige、igg、iga抗体水平,探讨其是否与csu发病存在相关性及可能的致病机制;3.探讨幽门螺杆菌全菌制剂及其蛋白组分是否对人lad2肥大细胞株有直接活化作用,筛选出作用最强的蛋白组分并评价其激活效力,进一步明确其具体组成成分。材料方法1.采用elisa方法检测csu患者和非荨麻疹健康对照组血清抗幽门螺杆菌igg抗体阳性率,判定幽门螺杆菌感染和csu发病相关性;2.表达、纯化、鉴定重组lpp20脂蛋白并制备尿素裂解的幽门螺杆菌全菌抗原,采用elisa法分别检测csu患者及非荨麻疹健康对照组中血清特异性抗幽门螺杆菌全抗原及抗lpp20蛋白的ige、igg、iga抗体水平;3.制备幽门螺杆菌尿素裂解液、幽门螺杆菌超声粉碎上清、福尔马林灭活幽门螺杆菌三种全菌制剂,将三种细菌全菌制剂同人lad2肥大细胞体外共培养,用甲苯胺蓝染色法及β-氨基己糖苷酶释放率评价三种幽门螺杆菌全菌制剂对人lad2肥大细胞株的直接活化作用;4.利用分子筛分离制备30个连续分子量梯度的幽门螺杆菌混合蛋白组分(mixed-proteincomponents,pcs),将制备好的混合蛋白组分分别同人lad2肥大细胞株共培养,用β-氨基己糖苷酶释放率评价不同蛋白组分对肥大细胞的直接活化作用并筛选出激活效力最强的混合蛋白组分;5.将筛选出的优势性混合蛋白组分pc17与人lad2肥大细胞株共培养,用elisa法检测β-氨基己糖苷酶、组胺、tnf-α、il-3、il-4、il-17、ifn-γ及ltb4释放情况,评价其对肥大细胞的剂量依赖性和时间依赖性活化效力;6.用酶消化法从sds-page电泳凝胶上切下并处理pc17混合蛋白组分条带,用液相色谱-质谱(lc-ms/ms)串联分析方法明确pc17的具体组成成分。结果1.csu患者的血清特异性抗幽门螺杆菌igg抗体阳性率(73.46%,155/211)显著高于无荨麻疹正常对照组(51.82%,71/137)(χ2=17.08,p<0.001);2.伴幽门螺杆菌感染的csu患者血清特异性抗幽门螺杆菌全抗原ige(0.082±0.002)、igg(1.053±0.022)、iga(0.660±0.022)抗体水平并未高于伴幽门螺杆菌感染的非荨麻疹对照组(ige0.078±0.003,igg1.222±0.034,iga0.849±0.037);3.伴幽门螺杆菌感染的csu患者血清特异性抗lpp20脂蛋白ige(0.085±0.003)、igg(1.459±0.012)、iga(1.229±0.020)抗体水平并未高于伴幽门螺杆菌感染的非荨麻疹对照组(ige0.082±0.005,igg1.494±0.016,iga1.251±0.033);4.β-氨基己糖苷酶释放实验显示,幽门螺杆菌尿素裂解液、幽门螺杆菌超声粉碎上清以及福尔马林灭活幽门螺杆菌在体外共培养体系中均能有效活化一定浓度的lad2肥大细胞,其β-氨基己糖苷酶释放率分别与阴性对照组比较,p<0.05,其活化作用随着工作浓度增大而增加;甲苯胺蓝染色实验表明,肥大细胞脱颗粒数量随着幽门螺杆菌制剂刺激浓度的增加而增大,并且各菌液处理组中的肥大细胞脱颗粒率变化趋势基本同其β-氨基己糖苷酶释放率变化趋势一致;5.通过分子筛层析法,幽门螺杆菌尿素裂解液被成功分成30个连续分子量梯度的混合蛋白组分(pcs)。通过比较这30个组分促肥大细胞β-氨基己糖苷酶释放效率比较,其中pc3,pc9,pc10,pc17,pc27和pc28均能有效活化lad2肥大细胞(其β-氨基己糖苷酶释放率均大于15%,且分别与阴性对照组比较,p<0.05);同时,pc3,pc9,pc10,pc17,pc27和pc28对lad2肥大细胞的激活作用表现为剂量依赖性,pc17显示出了较其它5种混合蛋白组分更优的肥大细胞活化效力;6.pc17幽门螺杆菌混合蛋白组分和幽门螺杆菌尿素裂解液均能有效刺激lad2肥大细胞释放β-氨基己糖苷酶、组胺以及tnf-α(分别和阴性对照组比较,p<0.05),其释放作用随着刺激浓度的增加而增加;且由4μg/mlpc17引起的以上三种炎性介质的释放作用相当于150μg/ml幽门螺杆菌尿素裂解液所引起的;7.pc17和幽门螺杆菌尿素裂解液均能有效刺激lad2肥大细胞释放il-3、ifn-γ和ltb4(分别与阴性对照组比较,p<0.05),其释放水平随着时间增加而增加;同时,pc17混合蛋白组分引起肥大细胞释放il-3、ifn-γ的作用优于幽门螺杆菌尿素裂解液(组间比较,p<0.05),引起释放ltb4的作用和后者相当;幽门螺杆菌尿素裂解液及其pc17组分在监测时间点内均未观测到能引起肥大细胞有效释放il-4和il-17a(分别与阴性对照组比较,p>0.05);8.液相色谱-质谱分析以及数据库比对显示,幽门螺杆菌混合蛋白组分pc17主要由23种蛋白质组成,其分子量范围在21 k Da到35 kDa之间。结论1.幽门螺杆菌感染和CSU发病有密切相关性,提示幽门螺杆菌是CSU病程中的重要作用因素;2.在幽门螺杆菌相关的CSU患者中,体液免疫产生特异性抗体并不是主要的诱发或/和促进荨麻疹发病因素;3.三种幽门螺杆菌全菌制剂,幽门螺杆菌尿素裂解液、幽门螺杆菌超声粉碎上清和福尔马林灭活的幽门螺杆菌,均能在体外有效活化人LAD2肥大细胞,这提示幽门螺杆菌很可能通过直接接触激活而非通过抗体介导的通路激活肥大细胞,进而参与CSU病程;4.PC17混合蛋白组分是幽门螺杆菌全菌中最优势性的人肥大细胞活化成分,它能有效激活人LAD2肥大细胞释放高水平的组胺、TNF-α、IL-3、IFN-γ和LTB4;5.PC17混合蛋白组分包含23种主要蛋白质成分,其分子量范围在21-35 kDa区间;6.PC17混合蛋白组分可被认为是参与与幽门螺杆菌感染相关的CSU发病机制的重要致病因子。