第一部分TRIM22对单核细胞凋亡的作用及其分子机制研究目的:TRIM22是TRIM蛋白家族成员,主要表达于人脾脏、胸腺等淋巴器官,以及外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC),尤其高表达于单核细胞。研究表明TRIM22在抗病毒免疫及炎症反应中发挥重要作用。且TRIM22是p53的靶基因,过表达TRIM22能抑制单核细胞U937的克隆性生长。因此我们推测TRIM22可能通过抑制单核细胞生长、促进其死亡来参与免疫调节。因此本研究主要观察高表达TRIM22对单核细胞凋亡的影响并探索TRIM22介导单核细胞凋亡的分子机制。研究方法:构建携带TRIM22基因的重组腺病毒表达载体并转染人单核细胞系THP-1细胞。以高表达TRIM22的THP-1细胞为研究对象,用星形孢菌素(staurosporine,STS)诱导细胞凋亡,或在胞多糖(lipopolysaccharide,LPS,100ng/ml)体外模拟炎症环境下,诱导细胞凋亡,采用流式细胞术检测细胞凋亡水平,Western blot方法检测caspase-9、caspase-3蛋白的裂解激活和细胞色素C的释放。采用化学抑制剂z-VAD-fmk阻断caspase信号通路,观察caspase信号通路对TRIM22分子介导的单核细胞凋亡的影响。Western blot法和化学交联法检测凋亡相关蛋白表达水平及寡聚化水平的变化。并进一步在人原代单核细胞中,用实时定量聚合酶链反应法(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)检测 LPS 体外炎症刺激下细胞凋亡过程中TRIM22与Bak的表达水平,并分析两者之间的相关性。研究结果:TRIM22重组腺病毒载体转染THP-1细胞后能获得高表达TRIM22的单核细胞。过表达TRIM22能显著增加STS诱导的THP-1细胞的凋亡率(87.8%±6.4%vs.23.1%±9.4%,P<0.01)。在LPS刺激体外模型炎症环境下,高表达TRIM22也能促进 STS 诱导的 THP-1 细胞凋亡(91.1%± 6.3%vs.25.5%± 14.3%,P<0.01)。高表达TRIM22促进了 caspase-9和caspase-3的裂解激活,导致细胞色素C释放增加。经z-VAD-fmk预处理阻断caspase信号通路后,TRIM22的促凋亡作用被抑制(10.9%± 3,5%vs.82.6%± 22.3%,P<0.01)。Bcl-2 蛋白家族中促凋亡蛋白 Bak 在TRIM22介导单核细胞凋亡过程中表达水平上调,寡聚化程度增高。在LPS体外炎症刺激下,人原代单核细胞凋亡过程中TRIM22与Bak的表达水平呈正相关(R=0.534,P<0.0001)。研究结论:TRIM22对单核细胞具有促凋亡作用,其机制可能与上调Bak蛋白表达,促进Bak蛋白寡聚化有关。第二部分TRIM22发挥促凋亡作用的重要功能结构域研究目的:既往研究表明RING结构域和B30.2/SPRY结构域是TRIM22发挥生物学功能的重要功能区域,前者具有E3泛素连接酶活性,与TRIM22抵抗多种病毒的作用密切相关,后者决定TRIM22的细胞核定位及核体的形成,且两者均是TRIM22发挥抗HBV活性及调节NF-κB信号通路的重要功能结构域。因此,本部分研究TRIM22的重要功能结构域RING结构域和SPRY结构域在其促凋亡过程中的作用,从而探讨TRIM22分子结构与其促单核细胞凋亡功能的相关性。研究方法:构建携带TRIM22野生型基因和结构域缺失突变型基因的三个腺病毒载体Ad.TRIM22、Ad.TRIM22-ΔRING 和 Ad.TRIM22-ΔSPRY,后两个分别代表 RING结构域(64-498aa)或SPRY结构域(1-352aa)缺失的TRIM22突变型腺病毒载体,转染人单核细胞系THP-1细胞,72小时后用Western blot法验证缺失突变型TRIM22在THP-1细胞中的表达。用星形孢菌素(staurosporine,STS)诱导细胞凋亡,采用流式细胞术检测细胞凋亡水平。用western blot法和化学交联法检测Bak蛋白表达水平和寡聚化程度。研究结果:Western blot检测证实TRIM22突变型腺病毒载体构建并转染THP-1细胞成功。与野生型TRIM22相比,RING结构域缺失突变型和SPRY结构域缺失突变型TRIM22对单核细胞的促凋亡作用均减弱(65.1%±6.6%vs.32%±11.3,P<0.05;65.1%± 6.6%vs.31.3%± 10.5%,P<0.05)。Western blot 结果显示 RING 结构域缺失和SPRY结构域缺失使TRIM22介导单核细胞凋亡过程中Bak表达的上调和寡聚化程度也均减弱。研究结论:RING和SPRY结构域是TRIM22发挥促凋亡作用的重要功能区域。第三部分TRIM22在脓毒症患者外周血单核细胞中的表达及其与单核细胞凋亡的相关性研究研究目的:第一部分研究发现TRIM22可以通过上调Bak蛋白的表达,促进Bak寡聚化,介导单核细胞凋亡。单核细胞凋亡是脓毒症过程中终止单核细胞活化,避免过度炎症反应,维持机体正常免疫应答状态的重要机制。因而推测TRIM22可能通过调节单核细胞凋亡,从而在脓毒症发生发展中发挥重要作用。因此,本部分研究通过观察成人及儿童脓毒症患者外周血单核细胞中TRIM22的表达水平及其与Bak蛋白表达水平的相关性,探讨TRIM22在脓毒症发生发展中的作用。研究方法:本研究纳入2013年5月至2013年7月大学附属医院外科加强监护病房(Intensive Care Unit,ICU)内符合脓毒症诊断标准的15例成人患者,并将同期8例非脓毒症危重病患者作为对照组。纳入2014年11月至2015年3月大学附属儿童医院儿童加强监护病房(Pediatric Intensive Care Unit,PICU)内符合脓毒症诊断标准的10例患儿,并将同期14例非脓毒症外科手术患儿作为对照组。所有纳入患者均在确诊脓毒症后24小时内抽取全血,分离外周血单核细胞,用实时定量聚合酶链反应法(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)检测 TRIM22 和Bak的表达水平。分别比较成人和儿童脓毒症患者与其对照组单核细胞中TRIM22的表达水平的差异,分析两者单核细胞中TRIM22与Bak表达水平的相关性。研究结果:成人脓毒症患者单核细胞中TRIM22的表达水平低于对照组(P<0.05),且与Bak分子表达水平呈正相关(R=0.6064,P=0.0006)。儿童脓毒症患者单核细胞中TRIM22的表达水平也低于对照组(P<0.05),并且TRIM22表达水平低的脓毒症患儿,其Bak分子表达水平有下降的趋势(R=0.5801,P=0.0787)。研究结论:脓毒症患者单核细胞中TRIM22的表达水平降低,且与Bak的表达水平呈正相关,提示TRIM22在脓毒症单核细胞凋亡中发挥重要作用。