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目的:研究反义 DNMT1对人宫颈癌 Caski细胞增殖和生长周期的影响,以及对Caski细胞中抑癌基因 APC(Adenomatous Polyposis Coli APC)的表达及其5ˊ端启动子区 CpG岛甲基化状态的影响;研究天花粉(Trichosanthin,TCS)蛋白对宫颈癌 Caski细胞 DNMT1( DNA- methyltransferase,DNMT)基因的表达和酶活性的影响,并探讨天花粉蛋白抗宫颈癌及去甲基作用的分子机制,寻找新型去甲基化药物。 方法:利用成功构建的反义 DNMT1真核表达质粒 pCMV-THM转染 Caski细胞,G418筛选,RT-PCR和Western- blotting法鉴定低表达 DNMT1的细胞株,MTT法、流式细胞术分析反义 DNMT1基因转染对 Caski细胞增殖的影响;RT- PCR、实时荧光定量 PCR、Western-blotting和甲基化特异性 PCR法研究反义 DNMT1基因转染对 Caski细胞 APC的表达及甲基化状态的影响。应用RT-PCR、实时荧光定量 PCR和Western-blotting分析检测天花粉蛋白对宫颈癌 Caski细胞 DNMTI基因表达的影响;应用DNMT1酶活性试剂盒检测天花粉蛋白对 DNMT1酶活性的影响。 结果:(1)成功获得低表达 DNMT1基因的Caski细胞株,细胞生长实验显示 DNMT1低表达对细胞增殖有抑制作用,并能够显著增加 G1期的细胞数(由50.1％增加到58％)。(2)转染 pCMV-THM质粒的Caski细胞中APC基因 mRNA表达水平升高3.45倍,同时 APC蛋白表达水平也明显升高;MSP法检测发现 DNMT1表达抑制导致 APC基因启动子区去甲基化。(3)经20、40、80?g/ml天花粉蛋白处理24h后,Caski细胞中DNM1基因 mRNA表达水平分别降低了39％、72％、79％,其蛋白表达水平也随着药物浓度增高而明显降低;用DNMT1活性试剂盒检测显示20、40?g/ml天花粉蛋白对 DNMT1酶抑制率分别是31.3％和56.7％。 结论:(1)在人宫颈癌 Caski细胞中DNMT1为高表达,降低 DNMT1基因表达水平能抑制细胞的增殖,提示 DNMT1可作为宫颈癌治疗的一个靶点。(2)Caski细胞低表达 DNMT1能诱导启动子区 CpG岛去甲基化而使 APC基因表达上调,从而恢复抑癌基因的功能。(3)天花粉蛋白去甲基化的作用可能是通过降低 DNMTs的表达和抑制DNMTs的活性而实现的。上述研究提示,天花粉蛋白可用作 DNMTs抑制剂,具有潜在的临床应用价值。