造血干细胞主要来源于骨髓、外周血和脐血。相对于外周血与骨髓，脐血造血干细胞具有来源方便、含量丰富、增殖能力强以及免疫排斥反应低等特点，在临床应用上日益受到关注。造血干细胞移植可用于造血重建、细胞免疫治疗以及基因治疗等，然而由于单份脐血造血干细胞数量有限，只能局限于儿童使用，所以脐血造血干细胞体外扩增成了拓展其应用范围的技术关键。 目前造血干细胞扩增的培养模式主要有静态和动态培养，由于培养特点的不同，导致造血干细胞在静态和动态培养系统中的生长特性呈现一定差异。此外，体外培养产生的造血干细胞生物学活性有可能发生变化，包括归巢和植入能力降低或丧失等。然而造血干细胞培养过程中出现的这些问题所涉及的分子机制并不清楚，为此，本研究主要考察了体外培养对脐血造血干/祖细胞基因表达的影响，旨在从基因表达的角度为优化体外培养环境大量扩增具有生物学功能的造血干/祖细胞提供科学依据。 在20％胎牛血清和基本细胞因子组合(SCF+IL-3+IL-6)的培养条件下，考察了脐血细胞在静态和动态培养系统中的生长规律，并运用SMART-PCR结合基因芯片以及差异显示技术比较了不同培养环境中扩增的CD34+造血干/祖细胞基因表达的变化及其特点。 与静态培养相比，动态培养在短期培养中有一定增殖优势，有利于造血干/祖细胞增殖；而在后续延长培养过程中却较快地诱导了造血干/祖细胞分化。搅拌速率对造血干/祖细胞凋亡和细胞周期分布没有显著影响，而不同混合特性却影响了造血细胞增殖。此外，基因表达分析结果表明在所检测的588个基因中，103个基因显著表达在动态和静态培养的CD34+造血干/祖细胞中，其中91个基因表达水平相似，只有12个基因差异表达。除了趋化因子CCL2在动态培养扩增的CD34+造血干/祖细胞中高表达外，其余11个基因均在静态培养中高表达，这些差异表达基因主要与细胞抗氧化反应、分化和趋化特性相关，提示在相同的培养条件下，静态培养环境致使CD34+造血干/祖细胞发生氧化应激反应而影响了细胞增殖特性等，这可能是导致静态培养中造血细胞增殖不如动态培养的原因之一，而动态培养却促进了造血干细胞分化。因此减少静态培养过程中的氧化应激效应和抑制动态培养的促分化因素将有助于造血干/祖细胞的扩增。 基因芯片分析也表明原代未培养的CD34+造血干/祖细胞显著表达63个基因，这些基因主要涉及造血干细胞增殖和分化、应激响应、细胞凋亡、转录调节以及细胞周期等，这对理解脐血造血干细胞的生物学特性以及指导体外培养过程提供了一定的分子基础。对比培养前后CD34+造血干/祖细胞基因表达图谱，发现140个基因显著表达，其中95个基因表达水平相似，20个基因在培养后的CD34+造血干/祖细胞中表达上调，25个基因表达下调。表达上调基因主要与促细胞分裂、抗氧化反应以及细胞凋亡相关；表达下调基因主要涉及细胞因子及其受体、细胞增殖以及粘附分子和受体等。上述结果表明体外培养环境对造血干/祖细胞具有三方面作用：(1)有效地刺激了CD34+造血干/祖细胞分裂，为细胞增殖提供原动力；(2)导致了氧化应激反应，说明常氧环境(21％pO2)对造血干细胞培养具有毒害作用；(3)改变了造血干/祖细胞增殖和分化特性以及归巢能力等。基因表达差异结果在一定程度上反映了体外培养环境与体内造血干细胞生长环境的差异性，深入研究这些差异表达基因可为认识体外培养扩增的造血干/祖细胞生物学性质发生变化的分子机制提供借鉴，也可为优化体外培养参数扩增具有生物学功能的造血细胞指明方向。 最后，为弥补基因芯片的分析缺陷，建立了差异显示技术研究生长环境对脐血造血干/祖细胞基因表达的影响。设计3条锚定引物和8条随机引物进行差异显示分析，总共获得30个差异表达基因片段，成功克隆和测序了5个差异表达基因片段，其中一个被鉴定为RAN基因，属于癌基因RAS家族成员。编码一种小的GTP结合核蛋白，与细胞微管和核膜形成、纺锤丝组装、DNA复制以及细胞周期有关。该基因在培养后的CD34+造血干/祖细胞中表达上调，且在动态培养系统中的表达水平高于静态培养，预示可能与造血干细胞增殖和分化有关。 本文研究工作表明，通过对体外培养过程中造血干细胞差异表达基因的鉴定将有助于理解体外培养环境因素与造血干细胞增殖、分化和凋亡等生物学特性之间的有机联系，为优化培养环境参数和设计生物反应器大量扩增具有生物学功能的造血干/祖细胞奠定理论基础。