研究背景阿尔茨海默病(AD)是最常见的神经系统变性疾病和导致痴呆的疾病。AD的主要临床特征是进行性的记忆力和认知功能减退。最新统计数据显示全世界平均3秒钟就有一个新发AD病例,预计到2050年全球将会有超过1亿5千2百万患病人群。AD的病理特征包括细胞外β淀粉样蛋白(β Amyloid protein,A β)沉积形成老年斑和细胞内过度磷酸化的tau 蛋白形成神经纤维缠结(Neurofibrillary tangles,NFTs)。虽然目前导致AD发生的具体病理生理机制仍然未完全研究清楚,但是越来越多的研究证据提示A β的沉积能够通过激活脑内小胶质细胞导致脑内神经炎症反应的发生。尸检病理研究发现T淋巴细胞出现在AD病变脑组织内神经炎性斑块和活化的胶质细胞周围。这一结果提示外周免疫系统中的淋巴细胞在推动神经炎症反应及神经细胞退行性改变的过程中起着重要的作用。在脑脊液中的淋巴细胞分析显示大约80%的淋巴细胞为CD4+的淋巴细胞。研究显示AD病人中存在不断增加的CD4+淋巴细胞的脑组织渗透,并且参与与A β引起的神经炎症反应。因此调节CD4+T淋巴细胞的增殖和分化可能是影响AD病理生理改变的有效途径。淫羊藿苷(Icariin,ICA)是一种存在于中药淫羊藿中的天然的黄酮甙类化合物。研究显示ICA有抗炎、神经保护等多种药理学作用。已有研究显示,在AD的动物模型研究中ICA能够减少A β沉积和神经凋亡的作用。并且研究发现ICA能够减少淋巴细胞活化及CD4+T淋巴细胞促炎性细胞因子的释放。这些研究证据均提示ICA存在抑制慢性神经炎症反应治疗潜能,可能对AD存在治疗作用。AD转基因动物模型能够模拟AD病人的行为学以及病理改变,因此被认为是研究AD治疗新方法的最优选择。APP/PS1小鼠模型首先由突变的淀粉样前体蛋白(APP)转基因株Tg2576和突变体(presenilin 1,PS1)转基因小鼠杂交而成。这种小鼠模型表现出明细的海马椎体细胞层中淀粉样蛋白沉积和神经元的缺失,在AD病理生理机制研究中应用广泛。在本研究中我们选择应用APP/PS1小鼠模型,并给予长时间的ICA处理(8个月),分析ICA对A 日沉积和CD4+T淋巴细胞介导的免疫炎症反应在外周和脑内的影响,分析ICA对AD的治疗潜能及其具体机制。研究方法1.试剂淫羊藿苷(高效液相色谱法鉴定纯度>98%),购自北京索莱宝科技有限公司。2.动物模型野生型C57BL/6小鼠(n=16,雄性,4月龄),转基因突变小鼠C57BL/6J-TgN(APP/PS1)(n=16,雄性,4月龄)购于北京华阜康生物科技公司实验动物研究所。所有小鼠饲养于12小时明暗交替的饲养环境中,并且可以自由获取水与食物。动物实验规程和程序已获批准,符合中华人民共和国山东大学动物实验伦理委员会的伦理标准。3.实验实施所有按照小鼠随机原则分为4组(每组8只):野生动物组(WT),野生型动物淫羊蕾苷处理组(WT+ICA),转基因动物组(Tg),转基因动物淫羊蕾苷处理组(Tg+ICA)。ICA在蒸馏水中溶解。实验动物经过2周适应性饲养后按照(60 mg/kg/d)给予ICA灌胃处理8个月,对照组给予蒸馏水灌胃。灌胃治疗结束后,排除严重虚弱和死亡动物,每组随机选择6只动物进入下一步实验。4.行为学检测采用莫里斯水迷宫实验评价实验动物的空间学习能力和记忆功能的损伤情况。在直径120厘米高50厘米的水池中注满水。水温控制在23土1℃,并且通过加入奶粉使得池水浑浊不透明。在实验动物结束灌胃药物处理结束1周后开始进行行为学实验。在前5天内实验动物每天在水池的4个不同象限的起点开始进行实验,探索位置固定在水面下约1厘米处的平台。实验动物在每个象限区域开始探索的时间为60秒。如果实验动物在60秒内不能找到水面下隐藏的平台,实验成绩记录为60秒,实验动物将被引导在平台上停留15秒钟。在实验的第6天,去除池水液面下的平台,记录实验动物在平台象限区域停留时间和穿越平台位置次数。使用Smart3.0自动摄影记录和分析系统跟踪和分析行为参数。5.ELISA方法检测海马A β行为学检测后实验小鼠用水合氯醛麻醉(水合氯醛腹腔注射)。经内眦动脉采集完外周血后,立即将实验动物大脑分离取出,在冰上并分离海马。之后将海马组织保存于液氮中。检测在海马组织中可溶性和不可溶性A β 40和A β 42。A β分离和检测方法参照酶联免疫试剂盒(BioLegend)说明测定。每个实验样本检测重复2次。应用酶标仪检测(Biorad,USA),记录在620纳米波长各个样本分光光度数据。6.流式细胞检测T淋巴细胞亚型采用内眦动脉采血,用肝素钠抗凝管收集实验小鼠的外周血。在4°C下,1000 rpm离心30分钟,收集上清血浆进行细胞因子检测。离心后细胞成分用1640培养液重悬,参照说明应用淋巴细胞分离液分离小鼠外周血淋巴细胞。之后细胞分别与相应的标记CD4+T、CD8+T、Th1、Th2、Th17和Tregs的特异抗体孵育。实验中所采用的主要抗体包括以下几种:FITC偶联抗小鼠的CD4抗体(识别CD4+T细胞)、APC/CY7-偶联的抗小鼠CD8抗体(识别CD8+T细胞)、PE/CY7偶联的抗小鼠γ干扰素(IFN-γ)抗体,PE偶联的抗小鼠白介素4(IL-4)抗体,APC偶联的抗小鼠白介素17(IL-17)抗体,AF647偶联的抗小鼠CD25抗体,PE偶联的抗小鼠Foxp3抗体。Th1细胞被定义为CD4+T细胞表达IFN-γ+,Th2细胞被定义为CD4+T细胞表达IL-4+,Th17细胞被定义为CD4+T细胞表达IL-17+,Treg细胞定义为CD4+T细胞同时表达的分子CD25+和Foxp3+。抗体孵育后细胞重悬于 PBS,并用流式细胞仪进行分析。结果采集及数据分析采用CytExpert软件。7.流式细胞仪液相多细胞因子分析在本研究中,我们采用流式细胞仪流式细胞仪液相多细胞因子分析方法测量了多种细胞因子在大脑和血清中的水平。试剂盒采用LEGEND plex多细胞因子分析试剂盒,具体方法参照操作手册。8.统计分析实验结果数据以均数土标准误表示。结果数据统计分析及统计图表绘制使用GraphPad Prism 7软件。结果数据统计采用双因素方差分析法,组间两两比较采用Fisher’ s LDS多重比较法。P值小于0.05定义为差异有统计学意义。研究结果1.ICA治疗减轻APP/PS1小鼠的认知障碍采用Morris水迷宫实验观察ICA对实验动物改善空间学习和认知缺陷的作用。在前5天的导航实验中APP/PS1小鼠(Tg)于野生型(WT)小鼠相比较表现出明显延长的探索水下平台的逃避潜伏期。应用ICA处理能够显著降低Tg小鼠的逃避潜伏期。研究结果显示ICA处理Tg小鼠与用蒸馏水处理的对照组相比能够在水迷宫实验的第4天及第5天明显减少定位水下平台的逃避潜伏期(图1A,P<0.05)。Tg小鼠与WT小鼠比较实验第6天在平台象限位置停留时间显著缩短,ICA处理能够显著增加Tg小鼠在平台象限区域停留时间(图1C,P<0.05)。Tg小鼠在行为学实验第6天穿越平台位置次数明显少于WT实验小鼠,经过ICA处理后尽管Tg小鼠穿越平台位置次数增加但并无统计学显著性差异(图1D,P>0.05)。这些行为学研究结果证明ICA治疗可以减轻APP/PS1小鼠的认知和记忆功能损伤。2.ICA治疗减少A β在APP/PS1小鼠海马组织内的沉积鉴于A β沉积是AD脑组织中主要病理改变之一并且海马区域是记忆与认知的关键区域,在研究中我们采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测海马区域组织内可溶性和不可溶性A β 40和A β 42的含量。在Tg小鼠海马组织内不可溶性A β 40和A β 42的含量水平高于WT组(图2A和B,P<0.05)。ICA处理显著降低了 Tg老鼠海马组织内不可溶性A β 40和A M2水平(图2A和B,P<0.05)。Tg小鼠海马组织内可溶性A β 40和A β 42相对于WT组显著增加,而ICA 8个月治疗显著降低可溶性A β 40沉积(图2C和D,P<0.05)。ICA处理降低可溶性A β 42在海马组织内的产生,但统计显示并无显著性差异(图2D,P>0.05)。这可能因为Aβ 42更容易聚合形成一种不溶性状态聚合体。我们的研究结果表明长时间ICA治疗可以减轻APP/PS1小鼠海马区域A β的沉积。3.ICA治疗可调节APP/PS1小鼠外周血CD4+T淋巴细胞的分化为了观察ICA对T细胞亚型调控的潜力,我们采用流式细胞术检测各组实验小鼠外周血中CD4+和CD8+T细胞的比例。结果显示Tg组小鼠与WT组小鼠相比CD4+T淋巴细胞比例明显升高(图3A和F,P<0.05)。但ICA治疗在Tg和WT小鼠中并没有改变总CD4+细胞的比例(图3A和F,P>0.05)。四组间实验小鼠中CD8+T淋巴细胞比例差异无统计学意义(图3A和G,P>0.05)。在CD4+淋巴细胞亚群中通过检测细胞内细胞因子IFN-γ,IL-4和IL-17分别检测Th1 Th2和Th17细胞比例。结果显示,Tg组小鼠中的Th1细胞比例明显高于WT组小鼠,ICA处理可以降低Tg小鼠Th1细胞的比例(图3B和H,P<0.05)。四组实验动物间Th2淋巴细胞比例差异无统计学意义(图3C和I,P>0.05)。Tg小鼠Th17细胞比例明显高于WT小鼠,并且ICA处理可降低Tg小鼠外周血汇总Th17细胞的比例,但在WT小鼠中ICA处理没有发现类似改变(图3D和J,P>0.05)。Tregs(CD4+CD25+Foxp3+)淋巴细胞的检测方法参照了我们课题组之前的研究中方法。如图所示(图3E和K,P>0.05)我们研究显示在Tg和WT组中Treg的百分比并没有统计学差异。而ICA处理可提高Tg组和WT组小鼠体内外周血Tregs的百分率(图3E和K,P<0.05)。4.ICA治疗减轻神经炎症反应并能够调节血浆和脑组织中炎症细胞因子的释放细胞因子诱导释放是AD中炎症反应和抗炎反应的重要病理生理过程。为了进一步研究ICA对神经免疫炎症反应的影响,我们在研究过程中采用流式细胞仪多因子检测试剂盒检测了血浆及脑组织内几种促炎细胞因子(IL-1 α,IL-1 β,IL-6,IL-10,IL-12p70,IL-17A,IL-23,IL-27,MCP-1,IFN-β,IFN-γ,TNF-α,and GM-CSF)的分泌情况。血浆检测结果显示Tg小鼠血浆中IL-1 β、IFN-丫、IL-6、MCP-1、IL-10、IL-17A含量均为阳性的水平明显高于WT组小鼠(图5,P<0.05)。ICA处理可显著降低Tg小鼠血浆中IL-1 β、TNF-α、IFN-γ、MCP-I、IL-17A 和 GM-CSF 的水平(图 5,P<0.05)。而血浆中炎性因子 TNF-α、GM-CSF、IL-1 α、IFN-β、IL-23、IL-12-p70 和 IL-27 在 Tg 和 WT 小鼠之间无统计学差异(图 5,P>0.05)。ICA 治疗对 IL-6、IL-10、IL-1 α、IFN-β、IL-23、IL-12-p70、和IL-27等炎性细胞因子无显著影响(图5,P>0.05)。在脑组织检测中数据显示,Tg组小鼠与WT小鼠相比IL-1 β、TNF-α、IL-6、IL-17A,GM-CSF的水平显著升高(图6,P<0.05)。ICA治疗可以显著降低Tg小鼠脑内IL-1β、IL-17A、IL-12p70、MCP-1的水平(图6,P<0.05)。ICA治疗可以提高Tg小鼠脑组织中IL-10的水平(图6,P<0.05)。WT与Tg小鼠脑组织内炎性细胞因子IL-23、IL-12p70、MCP-1、IL-10、IL-1 α,IFN-γ、IFN-β和IL-27的水平无统计学差异(图6,P>0.05)。ICA对Tg小鼠脑内 TNF-α、IL-1 α、IFN-丫、IFN-β、GM-CSF 和 IL-27 治疗无调节作用(图 6,P>0.05)。结论综上所述,研究证据已证实CD4+T淋巴细胞介导的神经炎症反应参与AD的病理改变过程。ICA能够干预慢性炎症病理改变过程,可能是一种有希望治疗AD的药物。因此探讨ICA对AD的治疗机制具有实用价值。我们的研究显示:1.APP/PS1小鼠的认知功能减退、脑内Aβ的沉积和慢性炎症病理改与CD4+T淋巴细胞亚群变化有密切关系。2.长期ICA治疗能够改善AD转基因动物模型APP/PS1小鼠的认知功能,并减轻小鼠脑内A β的沉积。3.长期ICA治疗能够调节APP/PS1小鼠体内Th1,Th17和Tregs等CD4+T淋巴细胞亚型的比例4.长期ICA治疗能够调节APP/PS1小鼠外周及脑组织内炎性细胞因子的水平,ICA是具有治疗AD潜能的药物。