研究背景及目的:放射治疗抵抗、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药以及治疗相关性肺毒性、肺损伤,是一直以来影响肺癌治疗的严重问题。有研究表明NF-KB与放疗抵抗相关。因此,在我们的研究中试图探索NF-KB在放疗敏感性、EGFR-TKI敏感性以及放疗介导肺损伤中的作用,同时也探索了放疗对EGFR-TKIs敏感性的影响。我们通过体外实验以及体内实验,使用NF-KB激酶抑制剂IMD 0354以及p65缺失模型来探明NF-KB通路对放疗敏感性以及EGFR-TKIs敏感性的影响;同时利用放疗诱导致肺纤维化小鼠模型探索IMD 0354对肺损伤的保护作用。在我们的实验结果中发现,放疗可以促进表达并激活MET信号,从而使得肺癌细胞对放疗或是EGFR-TKIs靶向药物产生抵抗;在使用药物(IMD 0354)或使用小干扰siRNA敲除p65来抑制NF-KB信号通路,就可以在体内及体外模型中恢复肺癌细胞对放疗或是EGFR-TKIs亦或是其二者联合效果的敏感性,并且发现这种敏感性的恢复是通过逆转MET活化实现的;此外,在小鼠放射性肺损伤/肺纤维化模型中IMD 0354可以显著的降低肺部毒性。这些发现暗示着抑制NF-KB信号通路可以改善肺癌放疗以及靶向药物EGFR-TKIs的敏感性,同时也可以降低肺癌治疗时的放射性肺损伤。方法:1.放射治疗由用于人体放射治疗的线性粒子加速器发射传统的X线(1-12Gy,3Gy/分)对PC9、A549细胞以及老鼠进行照射下,操作在室温下进行。2.细胞增殖检测我们使用MTT染色还原法,对细胞增殖情况进行检测。将肿瘤细胞接种于96孔板中,24小时后加入相关试剂,继续培养72小时后进行检测。3.蛋白印迹通过PVDF膜进行蛋白转移后,经过3次膜清洗后室温下进行封闭,然后在4度摇床上孵育相关一抗过夜,次日膜清洗后,进行HRP-二抗室温孵育后清洗膜,最终进行免疫发光检测。4.小RNA干扰实验我们选用针对p65及MET基因的小干扰RNA,在lip3000转染试剂协助下进行干扰实验,最终干扰结果有WB进行验证。5.细胞凋亡实验6孔板接种细胞过夜后,于放疗前1小时给予相应药物预处理,放疗后48小时收集漂浮及贴壁细胞进行凋亡检测。6.免疫荧光检测敲除p65后的PC9及A549细胞铺板,贴壁24小时后,放疗前1小时分别给予HGF处理或不处理,放疗后24小时进行免疫荧光检测r-H2AX。7.皮下瘤免疫组化对经过福尔马林固定,蜡块包埋的组织切片进行Ki-67、TUNEL检测及MET、H&E染色。8.放射线诱导肺损伤模型80只C57小鼠分为3组(空白,放疗,放疗+IMD),一次性予小鼠胸腔进行照射12GY后,给予或不给予IMD治疗,在不同时间点处死小鼠进行后续实验。果。9.恢复实验证实UBQLN1是miR-200c的功能性靶基因变。10.裸鼠皮下瘤模型PC9或A549细胞接种于裸鼠皮下,待成瘤至一定体积后进行分组,并依据分组给药,和或放射治疗。每周测量两次体重及皮下瘤体积。11.肺组织免疫组化染色对石蜡包埋的肺组织进行H&E、Masson、Fibronectin、Collagen I染色,及F4/80染色。12.统计分析所有实验数据均由3次独立实验的数据组成,展示为均数加减SD。所有数据的统计分析由GraphPad Prism软件完成;组间差异由双边T检验或是ANOVA检验完成,P<0.05视为有统计学差异义。结果:1.放射诱导NF-κB,MET和EGFR的激活并上调MET表达,而NF-κB抑制可逆转NF-κB和MET的活化,但不能逆转EGFR的激活首先,我们检查了放射后24小时内几种细胞信号通路的变化。放射增强了MET,EGFR和IκBα的活化以及MET表达。然后,我们评估了 NF-κB抑制对上述放射激活的信号传导途径的影响。用1或3μM刺激IMD 0354抑制活化的MET和IκBα,但不抑制活化的EGFR或其下游信号分子。照射诱导p65从细胞质转移到细胞核,而IMD 0354成功地减少了PC9和A549细胞中的这种现象。2.抑制NF-kB信号可以增强放射敏感性,增加放疗相关性凋亡我们通过药物抑制和siRNA敲除对NSCLC细胞的放射敏感性确定了消耗NF-κB的效果。尽管IMD 0354最初没有增强辐射诱导的γ-H2AX,但是第二轮照射增加了γ-H2AX水平。我们的细胞凋亡测定进一步证实了这一点。有趣的是,p65 siRNA对NF-κB的消耗增加了γ-H2AX和细胞凋亡的水平,以响应第一轮照射。另一方面,p65敲低直接下调MET和磷酸化MET的表达,不影响EGFR表达或活化。这些结果表明抑制NF-κB信号传导可以通过抑制MET但不抑制EGFR活化来增加NSCLC细胞的放射敏感性。3.HGF诱导MET活化独立并部分逆转p65敲低后辐射诱导的细胞凋亡和DNA损伤的作用我们评估了HGF是否可以影响p65耗竭对MET活化和放射敏感性的影响。正如预期的那样,辐射后p65的消耗抑制了MET表达。然而,尽管如此,HGF激活MET,以及在p65耗尽后减少辐射诱导的细胞凋亡和DNA断裂损伤。这些结果强烈表明,HGF刺激的MET活化降低了 NF-κB消耗j增加的细胞放射敏感性,进一步证实NF-κB消耗通过MET信号传导增强放射敏感性。。4.IMD 0354增加了体内肺癌的放射敏感性我们接下来检查了组合照射和IMD 0354在A549皮下肿瘤模型中的作用。尽管IMD 0354或辐射单一疗法对阻碍肿瘤生长具有最小或中等作用,但其组合导致肿瘤显着消退。通过Ki-67和TUNEL测定,我们发现与单独照射相比,联合疗法显着抑制细胞增殖并增加细胞凋亡。这些结果表明,IMD 0354和辐射的组合可能是NSCLC治疗的有希望的策略。5.照射降低了对EGFR-TKIs的易感性,这可以通过抑制NF-κB或MET来克服提前对携带EGFR突变的PC9细胞进行了放疗预处理,随后检测放疗后的细胞对AZD9291(三代EGFR-TKI)的敏感性。结果表明放疗所致的NF-kB/MET信号通路活化,可能导致肺癌细胞对EGFR-TKI敏感性降低。为了进一步验证这些结果,我们在PC9皮下瘤模型中验证低剂量AZD9291即可抑制肿瘤扩大,放疗联合AZD9291肿瘤并没有得到进一步控制。相反,在IMD0354、AZD9291(5mg/kg)、放疗三者联合会明显抑制肿瘤生长,增加细胞凋亡。更重要的是,单独放疗组及放疗联合AZD9291组的活化的MET显著增加,有趣的是三者联合治疗可以很好的抑制MET活化,即便是在放疗联合AZD9291组。这些体内实验结果强烈表明NF-kB/MET信号通路在放疗抵抗及放疗所致EGFR-TKIs抵抗中扮演重要角色。6.IMD 0354在放射性肺损伤小鼠模型中的作用我们接下来探索其在放射性肺损伤小鼠模型中的作用。在接受放射的小鼠中观察到皮肤损伤;IMD 0354喂药组可以显著推迟皮肤损伤的发生时间及缓解皮肤损伤的严重程度。另一方面,IMD 0354药物治疗放射后的小鼠肺组织中p65胞浆至胞核的转位被抑制。在放射线所致的肺损伤模型里,放射后两周及放射后6周里均观察到肺组织出血及炎性细胞募集。在放疗后第24周内,出现严重的肺纤维化;IMD 0354可以很好的抑制放疗后肺组织内部出血、免疫细胞浸润、以及肺纤维化的形成。同时在我们的小鼠模型中,放疗后第12周IMD 0354可以明显抑制单核巨噬细胞从肺间隔中移出,放疗后第24周可以抑制单核巨噬细胞在肺实变区域的聚集。这些结果表明IMD 0354可以通过抑制单核巨噬细胞激活从而保护肺组织免受放射损伤。结论:1.放射诱导NF-κB,MET和EGFR的激活并上调MET表达,而NF-κB抑制可逆转NF-κB和MET的活化,但不能逆转EGFR的激活2.抑制NF-kB信号可以增强放射敏感性,增加放疗相关性凋亡3.HGF诱导MET活化独立并部分逆转p65敲低后辐射诱导的细胞凋亡和DNA损伤的作用4.IMD 0354增加了体内肺癌的放射敏感性5.照射降低了对EGFR-TKIs的易感性,这可以通过抑制NF-κB或MET来克服6.IMD 0354可以保护放射性肺损伤