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白藜芦醇(Res)是一种非黄酮类多酚化合物,仅存在于葡萄等少数植物体内,且含量较低。研究表明Res具有抑制肿瘤、预防心血管疾病等生理活性。葡萄是大宗水果中唯一可以合成Res的水果,是人们从食品中获取Res的重要来源。目前市场上的Res供不应求,对其生物合成相关的研究也已成为热点。人们常常通过物理手段(如UV-C、UV-B等)和化学手段(如JA等)诱导Res的合成,其中UV-C辐射是一种比较有效的诱导手段。但是对其诱导合成机理的了解却非常有限。本研究主要以葡萄‘红芭拉蒂’(Vitis vinifera)成熟叶片作为试验材料,研究其Res合成对UV-C辐射的响应,特别是Res合成关键酶芪合酶(STS)基因转录调控的响应,希望能够进一步了解葡萄Res合成的生物学机制,为将来Res的生产提供理论依据。主要结果和结论如下: 1、UV-C辐射是诱导葡萄Res合成非常有效的手段。UV-C(6W/m2)处理后,葡萄叶片Res含量迅速增加,到处理后24 h,其Res含量是对照的480倍。而且Res合成的相关酶苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸-4-羟基化酶(C4H)、4-香豆酰辅A连接酶(4CL)、STS和白藜芦醇糖基转移酶(O-3-GT)基因的表达也迅速升高。 2、利用葡萄的基因芯片(Affymetrix),对UV-C处理后0、6、12h的葡萄叶片基因表达谱进行分析。结果表明UV-C辐射导致5274个探针代表的基因表达发生变化,上调的基因主要与次生代谢、胁迫、氨基酸代谢相关,下调的基因主要与光合作用相关。其中Res合成相关基因STS等的表达剧烈上调,变化倍数最大达到753.74倍,一些转录因子,如VvMYB14、VvMYB15、VvWRKY8、VvMYBPA1的表达也发生急剧上调,这些转录因子有可能与STS表达的调控有关。 3、分离克隆了STS启动子,并将其分成四个片段:片段A(A,-481--781bp)、片段B1(B1,-331--500 bp)、片段B2(B2,-181--350 bp)、片段C(C,-1--200 bp)。从‘红芭拉蒂’葡萄叶片中分离克隆了VvMYB14和VvWRKY8。酵母单杂交试验表明VvMYB14只能与STS启动子中片段B1的H-box结合,而VvWRKY8可与片段A和B中的W-box结合,但不与片段C中的W-box结合。也即VvMYB14与VvWRKY8都能结合STS启动子片段B。我们在葡萄‘霞多丽’(V.vinifera)悬浮细胞内使VvMYB14与VvWRKY8超表达,并利用双荧光素酶报告基因检测技术检测启动子活性,进一步验证了VvMYB14与VvWRKY8对STS启动子的调控作用。结果表明VvMYB14诱导STS启动子的活性;VvWRKY8抑制STS启动子的活性,并削弱VvMYB14对STS启动子的转录激活。UV-C处理后的‘红芭拉蒂’成熟葡萄叶片中及‘红芭拉蒂’、‘贝达’(V.labrusca×V.riparia)、‘植166’(V.monticola×V.riparia)三个品种叶片的发育过程中,STS、VvMYB14、VvMYB15、VvWRKY8的表达表现出同步性,因此葡萄中STS的表达可能受到VvMYB14和VvWRKY8的正负协同调控。