在本实验室前期锰营养研究成果的基础上,本论文共进行四个试验,采用原位结扎灌注肠段法和自然饲喂法,通过锰吸收动力学和二价金属转运蛋白1的表达研究有机与无机态锰在肉鸡小肠中的吸收机理。试验一为了研究肉鸡小肠各段中不同形态锰吸收机理的差异,成功克隆获得了鸡小肠DMT1全长cDNAs序列。鸡二价金属转运蛋白1(divalent metal transporter 1, DMT1)在动物胃肠道锰吸收过程中起重要作用。本研究根据哺乳动物DMT1同源蛋白氨基酸序列的保守性设计引物,应用3’RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术,扩增并克隆获得鸡小肠DMT 1 cDNA 3’端1 289 bp和1 092 bp两种片段,且发现其3’端翻译区和非翻译区存在差异。再根据鸡DMT cDNA 3’端片段的测序结果设计引物,扩增获得一个与3’端片段部分重叠的鸡DMT1 cDNA 5’端907 bp片段,并对其进行了克隆测序。最后根据鸡小肠DMT13’RACE片段和5’RACE片段序列信息进行拼接,从而获得鸡小肠DMT1cDNAs的全序列信息。研究结果表明,鸡小肠DMT1 cDNA有两种形式,一种全长为1 972个核苷酸,其中5’非翻译区104个核苷酸,编码区1 695个核苷酸,3’非翻译区173个核苷酸,编码一个长564个氨基酸残基的蛋白质;另一种全长为1 775个核苷酸,其中5’非翻译区104个核苷酸,编码区1 593个核苷酸,3’非翻译区78个核苷酸,编码一个长530个氨基酸残基的蛋白质。由两种形式DMT1cDNA推测获得的DMT1蛋白分子量分别为61.56 kDa和57.90kDa;等电点分别为5.51和5.75。对推测氨基酸序列进行疏水性和跨膜区分析表明,DMT1蛋白是一种跨膜整合蛋白,具有膜转运蛋白糖基化位点和底物结合位点的保守序列。两种推测的DMT1蛋白都具有12个跨膜区和三个糖基化位点,且有两个糖基化位点(332-335;345-348)位于DMT1蛋白的第7和第8跨膜区之间。DMT1cDNA第一种形式推导蛋白序列与已知人、小鼠、大鼠和猴等典型模式真核生物DMT1氨基酸序列进行比较,分别有80%、82%,、82%和78%的同源性;DMT1 cDNA第二种形式推导蛋白序列与已知人、小鼠、大鼠和猴等典型模式真核生物DMT1氨基酸序列进行比较,分别有83%、84%、84%和81%的同源性。最后根据鸡DMT1 cDNA的全序列信息,合成代表鸡DMT1 cDNA 3’最末端的新引物,运用末端PCR(End-to-End PCR)方法,直接从3’末端cDNA库体外扩增鸡小肠DMT1cDNA的拷贝。该全长cDNA拷贝被克隆进T载体,鉴定结果证明,已成功构建了鸡小肠DMT1正向和反向的全长cDNA克隆,为进一步研究肉仔鸡小肠各段中锰的吸收机理奠定基础。试验二用半体内原位结扎灌注肠段法研究快速生长肉仔鸡十二指肠、空肠和回肠中无机锰吸收机理的差异。共包括2个试验,试验1通过结扎肉仔鸡小肠各段在灌注后不同时间点对无机锰吸收率的变化来确定研究结扎肉仔鸡小肠各段锰吸收动力学的采样时间;试验2通过结扎肉仔鸡小肠各段中锰吸收速率随锰浓度的变化曲线来比较无机锰在肉鸡小肠各段中吸收机制的差异,并通过二价金属转运蛋白1mRNA的表达来研究其在结扎肉鸡小肠各段锰转运中的作用。试验1采用单因子的完全随机试验设计,共设灌注后5、15、30和40分钟4个采样时间点处理组。由于可从每个灌注肠段于以上4个时间点连续取样,故4个处理组共用同一组鸡只。加锰灌注液中以硫酸锰添加2.18 mmol/L(即120 ug/ml)锰。将12只28日龄的肉仔鸡按体重随机分为6个重复,每个重复2只鸡(为扣除内源影响,其中一只鸡作为零添加锰水平处理),每只鸡的十二指肠、空肠和回肠分别用作相应部位灌注肠段的一个重复,故每个采样点共有6个重复观测值。试验2采用单因子的完全随机试验设计,共设8个处理组,分别为0、0.13、0.27、0.54、1.09、2.18、4.37和8.74 mmol/L锰浓度组。结扎小肠各段中灌注液的采样时间为灌注后5分钟,结扎小肠各段小肠粘膜的采样时间为灌注后30分钟。将80只28日龄的肉仔公鸡分别按体重随机分成8个处理组,每组10个重复,每个重复1只鸡,每只鸡的十二指肠、空肠和回肠分别用作相应部位灌注肠段的一个重复,故每个肠段有10个重复观测值。试验1的结果表明:结扎肉仔鸡小肠各段对无机锰的吸收随灌注时间呈渐近线式的增长;灌注后5分钟内,结扎小肠各段对锰的吸收均随着灌注时间直线上升,故选取灌注后5分钟研究结扎肉仔鸡小肠各段对无机锰的吸收动力学;灌注后30分钟时,结扎小肠各段对锰的吸收达到其最大吸收的80%以上,故选取灌注后30分钟研究添加锰对结扎肉仔鸡小肠各段中DMT1 mRNA表达的影响。试验2的结果表明:结扎肉仔鸡十二指肠和空肠中无机锰的吸收动力学最适合饱和载体转运模型;而结扎肉仔鸡回肠中锰的吸收动力学最适合非饱和扩散模型。灌注后5分钟,结扎十二指肠锰载体转运系统对无机锰的最大吸收速率Jmax显著高于(P<0.05)结扎空肠锰载体转运系统对无机锰的最大吸收速率(94.08 vs 81.17 nmol/cm/min);但二者的Km值无显著差异(P=0.85;3.41 vs 3.60 mmol/L);无机锰在结扎回肠中的非饱和扩散系数为2.42×10-2 cm2/min。结扎小肠各段中二价金属蛋白1mRNA的水平表明:对照组结扎AA肉仔鸡十二指肠和空肠中DMT1 mRNA的水平显著高于回肠(P<0.0001)中的水平,但结扎十二指肠和空肠中DMT1 mRNA的水平无显著差异(P=0.2112)。处理组(添加2.18 mM锰组)结扎AA肉仔鸡十二指肠和空肠中DMT1 mRNA水平也显著高于回肠中的水平(P=0.0175)。与对照组相比,处理组结扎肉仔鸡小肠各段中DMT1 mRNA的表达量明显降低(P<0.001)。试验结果提示:无机锰在结扎肉鸡十二指肠和空肠中主要是以饱和载体转运的方式吸收的,而在结扎回肠中,主要是以非饱和扩散的方式吸收的。在结扎肉鸡十二指肠和空肠中至少存在一种无机锰的载体转运蛋白。DMT1mRNA主要在结扎肉鸡的十二指肠和空肠中表达,而回肠中表达很低;添加无机锰降低了结扎肉鸡小肠各段中的DMT1 mRNA的水平,提示DMT1在肉仔鸡十二指肠和空肠锰的转运过程中起重要作用。因不同形态锰在肉仔鸡十二指肠中的吸收差异最大,试验三通过结扎肉仔鸡十二指肠中不同形态锰吸收的动力学曲线来比较不同形态锰在肉仔鸡小肠中的吸收机制,并通过二价金属转运蛋白1mRNA的表达来研究不同形态锰在结扎肉鸡小肠中吸收机理的差异。本试验采用3(锰源)×7(水平)的两因子的完全随机试验设计。灌注液中添加的3种锰源分别为无机硫酸锰、本实验室前期采集的强络合强度有机锰(Qf=186,锰含量为10.18%)和中等络合强度有机锰(Qf=16.85,锰含量为9.06%);灌注液中添加锰的浓度分别为0.13、0.27、0.54、1.09、2.18、4.37和8.74 mmol/L;同时设置不添加锰对照组,共22个处理。灌注时间为30分钟内,肉仔鸡结扎十二指肠对锰的吸收随着灌注时间直线上升,故选取灌注后30分钟研究结扎肉仔鸡十二指肠对不同形态锰的吸收动力学。将220只28日龄体重相近的AA肉公鸡随机分到22个处理组中,每组10个重复,每个重复1只鸡,故每个肠段有10个重复观测值。试验结果表明:结扎十二指肠对不同形态锰吸收的动力学都最适合饱和载体转运模型;中等络合强度有机锰(MnAAB,Qf=16.85)和强络合强度有机锰(Bioplex Mn,Qf=186)在结扎肉仔鸡十二指肠段中的饱和载体转运系统Jmax值和Km值都显著高于(P<0.001)无机硫酸锰;但中等络合强度有机锰和强络合强度有机锰在结扎肉仔鸡十二指肠中饱和载体转运系统的Jmax和Km值无显著差异(P>0.66)。不同形态锰对结扎肉仔鸡十二指肠中总DMT1 mRNA水平具有显著影响(P=0.0001)。无机硫酸锰、中等络合强度和强络合强度有机锰组分别比对照组总DMT1 mRNA的表达量下降了80.99%(P<0.0001)、65.58%(P<0.0001)和58.20%(P=0.0003)。中等络合强度和强络合强度有机锰组分别比无机锰组总DMT1 mRNA水平上升了81.1%(P=0.0095)和119.9%(P=0.0011)。中等络合强度和强络合强度有机锰组总DMT1 mRNA水平间无显著差异(P=0.4018)。I型DMT1 mRNA在肉仔鸡十二指肠中表达量很低,且不同形态锰对结扎肉仔鸡十二指肠中I型DMT1 mRNA水平无显著影响(P=0.4828)。添加不同形态锰对结扎肉仔鸡十二指肠中II型DMT1 mRNA水平有显著影响(P=0.0001)。无机硫酸锰、中等络合强度和强络合强度有机锰源组分别比对照组II型DMT1 mRNA的表达量下降了83.01%(P<0.0001)、66.84%(P<0.0001)和59.17%(P=0.0001)。中等络合强度和强络合强度有机锰组II型DMT1 mRNA水平分别比无机锰组增加了95.1%(P=0.0006)和140.2%(P=0.0004)。中等络合强度和强络合强度有机锰组II型DMT1 mRNA水平之间不无显著差异(P=0.3721)。试验结果表明:不同形态锰在结扎肉鸡十二指肠中均主要是以饱和载体转运的方式吸收;但添加络合的有机锰组肉仔鸡十二指肠中总DMT1 mRNA水平高于比无机锰组。肉仔鸡十二指肠中DMT1 mRNA主要以II型DMT1mRNA表达;添加不同形态锰降低了结扎肉鸡小肠中II型DMT1 mRNA水平,而对I型DMT1mRNA表达水平没有影响。试验四通过比较肝门静脉血浆中的锰含量来研究不同形态锰在肉仔鸡小肠中的吸收差异;通过不同形态锰对肉仔鸡小肠各段中DMT1mRNA水平的影响揭示不同形态锰在肉仔鸡小肠中吸收机理的差异。试验采用单因子的完全随机试验设计,共设4个处理组,分别为:零添加锰水平对照组、硫酸锰组、本实验室前期应用的中等络合强度(Qf=16.85;Mn-AAB)和强络合强度(Qf=186;Bioplex Mn)有机锰组。将256只14日龄缺锰AA肉公鸡按体重随机分到以上4个处理组,每组8个重复,每个重复8只鸡。结果表明:(1)在试验的第7天和第14天,肝门静脉血浆锰含量均受到添加锰源的显著影响(P<0.0001)。在第7天,无机硫酸锰、中等和强络合强度有机锰组分别比对照组肉仔鸡的血浆锰含量增加了59.7%(P=0.0029)、112.4%(P<0.0001)和133.1%(P<0.0001)。中等和强络合强度有机锰组比无机硫酸锰组分别增加了32.9%(P=0.0075)和45.9%(P=0.0004)。强络合强度有机锰源处理组比中等络合强度有机锰源处理组增加了9.7%,但差异不显著(P=0.2669)。在试验的第14天,无机硫酸锰、中等和强络合强度有机锰组分别比对照组肉仔鸡的血浆锰含量增加了31.0%(P=0.0184)、78.3%(P<0.0001)和128.6%(P<0.0001)。中等和强络合强度有机锰组比无机硫酸锰组增加了36.1%(P<0.0001)和74.5%(P<0.0001)。强络合强度有机锰组比中等络合强度有机锰组增加了28.2%(P=0.0004)。(2)肉仔鸡十二指肠和空肠中总DMT1 mRNA水平极显著(P<0.01)高于回肠,十二指肠中总DMT1 mRNA水平极显著(P<0.01)高于空肠。与对照组相比,添加不同形态锰显著增加了肉仔鸡十二指肠和空肠中总DMT1 mRNA水平(P<0.0001);而对回肠中总DMT1 mRNA水平无显著影响(P=0.1793)。无机硫酸锰、中等和强络合强度有机锰组十二指肠总DMT1 mRNA水平分别比对照组增加了44.2%(P=0.2530)、224.3%(P<0.0001)和286.8%(P<0.0001)。中等和强络合强度有机锰组十二指肠总DMT1 mRNA水平比无机硫酸锰处理组增加了124.7%(P<0.0001)和168.1%(P<0.0001),强络合强度有机锰组十二指肠总DMT1 mRNA水平显著高于(P=0.0995)中等络合强度有机锰组。无机硫酸锰、中等络合强度和强络合强度有机锰组空肠总DMT1 mRNA水平分别比对照组增加了47.3%(P=0.0935)、150.7%(P<0.0001)和149.7%(P<0.0001)。中等和强络合强度有机锰组空肠总DMT1 mRNA水平比无机硫酸锰处理组增加了70.1%(P=0.0051)和69.4%(P=0.0065),强络合强度与中等络合强度有机锰组空肠总DMT1 mRNA间无显著差异(P=0.9318)。(3)肉仔鸡十二指肠和空肠中I型DMT1 mRNA水平极显著(P<0.01)高于回肠;添加不同形态锰对肉仔鸡小肠各段中I型DMT1 mRNA表达无显著影响(P>0.28)。试验结果提示:自然饲喂的肉仔鸡小肠中DMT1mRNA主要表达在十二指肠和空肠,而回肠最低;添加不同形态锰增加了肉仔鸡十二指肠和空肠中总DMT1 mRNA水平。与无机锰相比,中等和强络合强度的有机锰增加了肉仔鸡十二指肠和空肠中DMT1 mRNA的表达,且强络合强度的有机锰又高于中等络合强度的有机锰。综上所述,无机锰在肉仔鸡十二指肠和空肠中主要以饱和载体转运方式吸收,而在回肠中主要以非饱和扩散的方式吸收。锰转运蛋白DMT1主要在肉鸡十二指肠和空肠中表达,而回肠中很低,提示其在肉鸡十二指肠和空肠锰的载体转运过程中起重要作用。络合(螯合)有机锰在肉鸡十二指肠中主要是以饱和载体转运的方式吸收;中等和强络合强度有机锰组肉仔鸡十二指肠和空肠中锰转运蛋白DMT1 mRNA水平均明显高于无机锰组,且强络合强度有机锰组又高于中等络合强度有机锰组。以上研究结果对于我国肉鸡生产中科学研制开发和应用中等和强络合强度的新型高效吸收锰添加剂,奠定了坚实的理论基础。