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由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的稻瘟病是水稻生产中最为严重的病害之一,稻瘟病的可持续性控制仍是水稻生产中亟待解决的重要难题之一。开展稻瘟病菌基因功能的研究,有利于更好的了解其生物学特性,从而有利于提出稻瘟病针对性的防控措施。另一方面,由于稻瘟病菌培养和遗传操作的简易性,以及基因组测序的完成,稻瘟病菌业已成为丝状真菌分子生物学和侵染机制研究的重要模式物种,而其与水稻的互作研究也是植物病原真菌与寄主互作机制研究的模式之一。一氧化氮（Nitric oxide,NO）在生物体同时具有毒性和保护作用。NO作为一个重要的信号分子在诸多生物学过程中发挥着重要作用,另一方面过量的NO可使细胞受到亚硝化胁迫而引起毒害。植物与病原真菌互作中,病原菌的PAMPs（Pathogen-Associated Molecular Patterns）和效应子可以诱导寄主细胞NO的迸发,激活一系列的抗病反应。植物源NO的迸发同时也为寄主营造一个抗微生物的环境,直接或间接阻碍病害菌的侵染。另一方面,植物病原菌也能合成内源NO,它参与真菌的产孢、侵染结构的分化和致病性等生物学过程。因此,维持细胞内NO代谢平衡,对于实现病原菌正常的生理和生物学功能具有重要意义。微生物已经进化有回避NO胁迫的机制,其中亚硝基谷胱甘肽还原酶（S-nitrosoglutathione reductase,GSNOR）和黄素血红蛋白（Flavohemoglobin）可以通过间接或直接代谢NO成无毒分子来保护自身不受到NO的毒害。生物体中,S-（羟甲基）谷胱甘肽脱氢酶（EC 1.1.1.284）具有GSNOR活性,它可以特异性的将GSH和NO的自然反应产物S-亚硝基谷胱甘肽（S-nitrosoglutathione,GSNO）还原成NH3和谷胱甘肽二硫化物（GSSG）。S-（羟甲基）谷胱甘肽脱氢酶属于Ⅲ类酒精脱氢酶,也参与谷胱甘肽依赖的甲醛脱毒。这个酶在生物体中普遍存,且高度保守。在酿酒酵母中,S-（羟甲基）谷胱甘肽脱氢酶编码基因SFA1缺失,导致突变体为对NO胁迫的超敏感性和胞内亚硝基硫醇（S-nitrosothiols,SNOs）的异常积累。黄素血红蛋白是微生物中普遍存在的一种球蛋白,它在有氧条件下可以将NO氧化成无毒的NO3-,在无氧条件下亦可将NO转化为无毒的N2O。微生物黄素血红蛋白基因的缺失往往导致突变体对NO胁迫超敏感,其生长受到抑制,而且也可引起病原菌致病性的减弱甚至丧失。稻瘟病菌与水稻互作时,一方面水稻细胞受稻瘟病菌效应子的激发能产生NO;另一方面稻瘟病菌合成的内源NO在调控病菌发育和侵染早期过程中发挥着重要作用。由此推测,不管是稻瘟病菌自身发育还是与寄主互作时,维持稻瘟病菌细胞内NO代谢平衡对于NO行使正常的生理和生物学功能具有重要的意义。因此,本文对稻瘟病菌中NO降解相关基因亚硝基谷胱甘肽还原酶和黄素血红蛋白编码基因开展了功能研究,结果如下:根据酿酒酵母SEA1编码蛋白序列在稻瘟病菌基因组数据库中检索到与其高度同源的基因MGG06011。MGG06011编码蛋白包含所有已知与维持S-（羟甲基）谷胱甘肽脱氢酶的结构和功能相关的保守位点。用MGG06011基因互补酿酒酵母突变体Δsfa1,能够恢复Δsfa1在甲醛培养基上的生长缺陷和对GSNO的完全还原能力,表明了MGG06011与酵母SFA1功能同源。由此,我们认为MGG06011是稻瘟病菌S-（羟甲基）谷胱甘肽脱氢酶编码基因,且其同时具有甲醛脱毒和GSNO还原活性,命名为MoSFA1。利用GFP基因融合表达,结果表明MoSFA1蛋白分布于稻瘟病菌细胞质中;MoSFA1基因表达分析显示,在孢子萌发、附着胞形成和与植物互作中MoSFA1基因表达随着发育状态受到调控。我们构建了MoSFA1基因缺失突变体和互补子,并对它们的表型进行了分析。结果显示,MoSFA1基因缺失导致突变体在包含有甲醛的CM平板上不能生长,且突变体生长被NO供体SNP所抑制。突变体细胞内SNOs异常积累,且SNOs积累受到外源NO诱导。MoSFA1基因缺失导致突变体在CM平板生长减慢、菌丝黑色素化程度下降、分生孢子产量显著降低。MoSFA1基因缺失突变体对水稻致病性下降,但不影响对受伤叶片的致病力。我们由此推测,MoSFA1基因在稻瘟病菌致病过程中至少参与调控侵入和活体寄生,但对死体寄生无影响。MoSFA1基因缺失突变体分生孢子萌发和附着胞形成均正常,但突变体附着胞膨压降低导致侵染率下降、侵染菌丝的生长也受到抑制。MoSFA1缺失突变体侵染的寄主细胞内H202异常积累。而MoSFA1基因缺失导致突变体对氧化剂超敏感,突变体抗氧化酶SOD和POD酶活性下降,胞内还原型GSH含量下降。但是MoSFA1基因缺失突变体挑战接种不影响水稻PR基因的表达,说明MoSFA1基因缺失导致的致病性的下降与亲和寄主PR基因介导的防卫反应无关。由此,表明MoSFA1基因参与调控稻瘟病菌抗氧化系统,MoSFA1基因在稻瘟病菌与寄主互作中参与调控寄主活性氧的清除。此外,MoSFA1基因缺失影响突变体对硝酸盐和亚硝酸盐的利用,但突变体中NR和NiR基因却均被极显著上调表达。推测MoSFA1参与调控的蛋白质S-亚硝基化修饰有关,氮素利用相关蛋白被异常修饰可能导致构象或活性的改变,但仍需要后续研究证实。在稻瘟病菌基因组数据库中检索到与酿酒酵母黄素血红蛋白编码基因YHB1高度同源的基因MGG00198。MGG00198编码蛋白包含已知维持黄素血红蛋白结构和功能所必需的相应保守位点。MGG00198基因互补酵母突变体△yhb1,能够恢复△yhb1在含GSNO培养基中的生长缺陷,表明了MGG00198与YHB1功能同源。MGG00198基因编码稻瘟病菌黄素血红蛋白,命名为MoHB1。基因表达分析显示,在孢子萌发和附着胞形成过程中MoHB1基因表达受发育状态的调控。基因受外源NO处理被迅速诱导表达,且表达水平具有剂量效应。我们构建了MoHB1基因缺失突变体和互补子,并对它们的表型进行了分析。结果显示,MoHB1基因缺失导致突变体对外源NO和H202胁迫超敏感,在含有不同NO供体和H202培养基上的生长与野生型比较受到显著抑制。与MoSFA1基因缺失突变体比较,外源NO对MoHB1基因缺失突变体的生长抑制显著大于前者,而氧化剂对MoHB1基因缺失突变体的生长抑制则正好相反。但是,MoHB1基因缺失并不影响突变体正常的营养生长、产孢和致病性。MoHB1缺失导致突变体中MoSFA1基因在分生孢子萌发和附着胞形成过程中表达水平进一步增强,表明MoHB1和MoSFA1在功能上可能存在部分互补;MoHB1和MoSFA1基因基因双缺失突变体,进一步增加了对NO胁迫和氧化剂的敏感性。但双基因缺失突变体并没有导致对水稻致病力的进一步下降。综上所述,本研究鉴定了稻瘟病菌中GSNOR和黄素血红蛋白编码基因MoSFA1和MoHB1,并对它们在稻瘟病菌抵御NO和氧化胁迫、生长发育和致病过程中的功能进行了探索。结果表明,MoSFA1基因缺失造成对NO胁迫超敏感,导致突变体SNOs异常积累,即突变体蛋白质具有更高的蛋白质S-亚硝基化修饰水平;MoSFA1基因缺失影响附着胞膨压导致侵染率下降,影响抗氧化酶系统活性导致突变体抗氧化能力下降,从而使得突变体在生长发育上的缺陷和对水稻致病力的下降。此外,MoSFA1基因缺失也影响了突变体氮素的同化。MoHB1基因缺失造成对NO和H202胁迫超敏感,与MoSFA1基因相比MoHB1基因在应对外源NO胁迫中发挥更重要的作用。MoHB1和MoSFA1双基因缺失加重了对NO和氧化剂的敏感性,但是并不导致对水稻致病力的进一步丧失。总之,MoSFA1介导的NO降解途径在稻瘟病菌正常发育和致病过程中发挥着重要作用,而MoHB1则被用于回避外源NO胁迫。本研究的结果对于进一步揭示稻瘟病菌中NO的功能及稻瘟病菌致病机制具有重要意义,并可为稻瘟病新型防治药物的设计奠定理论基础。