里氏木霉(Trichoderma reesei)是目前生产纤维素酶的主要工业菌株,其分泌的纤维素酶系能够将木质纤维素水解为葡萄糖以供生物乙醇的生产。然而,在工业降解木质纤维素的过程通常需要纤维素酶具有耐热和高稳定性等特性。因此,在里氏木霉中表达热稳定纤维素酶是改良纤维素酶系的策略之一。此外,里氏木霉中的蛋白酶可能会对蛋白分泌表达产生影响,但目前对其认识仍不清晰。本论文一方面在里氏木霉中异源表达热稳定纤维素酶对里氏木霉酶系进行改良,另一方面研究里氏木霉液泡蛋白酶功能,然后利用液泡蛋白酶靶点深入改造热稳定纤维素酶异源表达的工程菌株,从而构建起纤维素酶系优化的里氏木霉工程菌。主要研究内容如下:(一)在里氏木霉中异源表达热稳定纤维二糖水解酶Te-Cel7A利用组成型强启动子Pcdna1和内源cbh1信号肽SP成功构建了Te-Cel7A的表达盒。表达盒转化里氏木霉QP4原生质体后筛选得到了一株纤维素水解能力强的转化子,命名为QTC14。在葡萄糖条件下QTC14能够分泌有活力的且酶成分单一的Te-Cel7A蛋白。对其酶学性质进行分析发现,Te-Cel7A的最适酶活温度为65℃,最适p H为5.0,与T.emersonii所分泌的天然Te-Cel7A的性质相似,说明在里氏木霉中可以异源表达热稳定纤维素酶。在产酶发酵条件下,里氏木霉QTC14的CBH酶活相较出发菌株QP4提高了28.8%,FPA酶活提高了65.2%。另外,QTC14总纤维素酶和CBH的热稳定性也高于出发菌株QP4。当QTC14的发酵酶液用于糖化不同木质纤维素底物时,QTC14对脱木素木糖渣和未脱木素木糖渣的糖化效率均高于出发菌株QP4。特别是糖化脱木素木糖渣时,QTC14的糖转化率为49.3%,与QP4的糖转化率相比提高了13.9%。这说明里氏木霉可以成功实现异源热稳定纤维素酶的表达,产生的重组纤维素酶系在生物质转化方面具有潜在的应用价值。(二)里氏木霉液泡丝氨酸蛋白酶Spt1的功能研究里氏木霉蛋白酶Spt1的蛋白序列分析发现,该蛋白酶属于枯草杆菌蛋白酶家族中的类枯草杆菌蛋白酶,具有前导肽,可能属于液泡蛋白。为探究里氏木霉Spt1的功能,我们分别构建了Spt1缺失菌株Δspt1及回补菌株Rspt1。结果显示,Spt1的缺失使得里氏木霉孢子产量显著降低,Spt1回补之后生孢性状恢复,说明Spt1参与了里氏木霉孢子的形成。同时,Δspt1在不同碳源上的生长速率不受影响,但是影响菌株对纤维素的降解能力。通过分析Δspt1和Rspt1的胞外纤维素酶活力发现,Δspt1的胞外蛋白分泌量、FPA、EG酶活、CBH酶活和BGL酶活均显著下降,而Spt1回补之后,纤维素酶活力得到恢复。上述结果说明,Spt1与里氏木霉纤维素酶的合成与分泌有关。为了确认Spt1是否位于液泡,进一步利用绿色荧光蛋白对Spt1进行细胞定位研究,结果表明里氏木霉丝氨酸蛋白酶Spt1位于液泡中。为了研究Spt1对纤维素酶系的改良作用,我们利用spt1自身启动子和组成型强启动子cdna1分别构建了Spt1过表达菌株SOE和SOD。通过分析SOE和SOD的纤维素酶活力进行发现,Spt1的过表达能够显著提高里氏木霉的纤维素酶的酶活。尤其利用组成型强启动子cdna1构建的Spt1过表达菌株SOD,与出发菌株QP4相比,其胞外蛋白量、FPA、EG酶活、CBH酶活和BGL酶活分别提高了65.9%、140%、48.8%、265%和260%。说明Spt1是改造里氏木霉酶系的有效靶点。(三)在里氏木霉QTC14中过表达Spt1为构建纤维素酶系更加优良的里氏木霉工程菌,我们将Spt1在异源表达热稳定性Te-CBH1的里氏木霉工程菌QTC14中进行了过表达研究,成功构建了里氏木霉工程菌STC。通过分析STC和QTC14的纤维素酶活力发现,STC与QTC14相比,其胞外蛋白量、FPA、EG酶活、CBH酶活和BGL酶活分别增长了10%、10%、22%、15%、34%。这些结果表明,以液泡蛋白酶Spt1为靶点,可以实现对里氏木霉工程菌株的进一步改良,提升纤维素酶分泌水平及纤维素酶系活力,从而有助于降低纤维素酶生产成本并促进生物乙醇工业发展。