单甲氧基聚乙二醇—醛(mPEG-ALD)化学修饰超氧化物歧化酶(SOD)的研究

来源 :广州中医药大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:xiaofengwuxuan123
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目的:超氧化物歧化酶(SOD)是一种专一清除超氧阴离子的酶,对机体具有保护作用,广泛应用于抗辐射、抗衰老、抗炎症等方面,具有重要的药用价值。但是由于SOD在体内的半衰期(静注时通常只有6-15min)很短,限制了其在临床上的有效性和实用性。利用化学方法对SOD进行修饰改善其临床应用方面的性质是目前的一门热门技术。目前关于国内外对于SOD的修饰已经有很多相关方面的研究,本研究旨在得到一条工艺路线简单,修饰位点固定的工艺路线,为修饰SOD的产业化提供实验研究基础。方法:本实验利用对羟基苯甲醛对L-赖氨酸进行预实验性修饰,初步确定醛基修饰氨基的可行性。预实验成功之后,使用单甲氧基聚乙二醇-醛修饰SOD,对修饰后SOD的进行SDS-PAGE凝胶电泳测试,鉴定mPEG-醛对于SOD的修饰效果。本实验主要从氨基的修饰方面进行研究。考虑到大分子蛋白类物质反应困难,价格昂贵等因素,先以小分子物质作为预实验考察醛基修饰氨基的可能性。采用对羟基苯甲醛为原料,在PH5.3弱酸性环境下修饰L-赖氨酸,与L-赖氨酸上的N末端α-氨基发生亲核取代反应,生成shiff base,然后加入还原剂氰基硼氢化钠,生成稳定的定点的氨基修饰产物。通过红外吸收光谱对实验结果进行鉴定,可知实验取得了满意的结果。对反应工艺以进行优化,确定了最佳物料比为对羟基苯甲醛:氰基硼氢化钠:L-赖氨酸(5:2:1),最佳反应温度为室温。采用高效毛细管电泳对反应产物进行分离,从侧面映证了氨基能够被醛基所修饰,且确定了最佳分离PH值为10.7。由于预实验证明醛基修饰氨基的路线是可行的,故使用大分子的mPEG-醛修饰蛋白酶SOD。按照物料比mPEG-醛:氰基硼氢化钠:SOD(6:200:1)的比例进行反应,用分子量10000的透析袋透析得到产物,使用SDS-PAGE凝胶电泳进行分析。成果:由以上实验方法得出的结果可证明,醛基能够成功修饰氨基,得到定点的修饰产物,由此基础上验证单甲氧基聚乙二醇-醛可以成功修饰超氧化物歧化酶。且该法反应具有反应条件温和,选择性高等突出优点,虽然选择性仍达不到100%,但是修饰剂与赖氨酸反应的不均一性大大降低。可以克服氰脲酰氯法修饰法的不足。结论:据此,我们推断使用mPEG-醛对超氧化物歧化酶可以实现进行高选择性修饰。但是具体修饰位点还不清楚,还应作进一步研究。本文对活性蛋白质的修饰工艺有重要的参考价值。接下来对mPEG-醛修饰超氧化物歧化酶的修饰产物理化性质做进一步研究。
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