猪流行性腹泻（Porcine epidemic dirrhea,PED）是由猪流行腹泻病毒（Porcine epidemic dirrhea virus,PEDV）引起的一种急性、高传染性猪肠道疾病。其临床症状主要表现为腹泻、呕吐、脱水、厌食和迅速消瘦等,虽然各种年龄阶段的猪对PEDV都易感,但10日内的仔猪对PEDV更易感,致死率高达100%。1971年,世界上第一例PED暴发于英格兰地区的架子猪和育肥猪群中,症状只是表现为腹泻。1984年,宣华等首次证实我国某些地区猪群中也存在PEDV感染。2010年底开始,我国从南到北,从东到西的很多地区猪场的仔猪腹泻疫情暴发,并伴随着新的流行特征出现,尤其是发病率和死亡率高,造成100万头仔猪死亡,一周龄仔猪死亡率竟高达80%-90%,给我国养猪业带来了巨大的经济损失。针对PEDV经典毒株（CV777）的传统疫苗不能对新流行PEDV毒株提供良好的保护;目前,对于造成PEDV新流行毒株高致病性的机制尚不明确。抗原变异是导致PEDV经典株弱毒/灭活疫苗对目前流行毒株免疫失败的主要原因之一。PEDV S蛋白在病毒感染宿主细胞的吸附、入侵以及膜融合等过程中发挥重要作用;S蛋白也是诱导宿主产生中和性抗体的主要靶蛋白之一。猪流行性腹泻病毒经典毒株与流行毒株S蛋白氨基酸序列比对显示,其s基因发生了明显的变异,且在S蛋白的N-端存在一个高变区(1-496aa,S1_0A)。为了找出S蛋白高变区因基因突变导致的表位改变,在表位水平解析PEDV新流行毒株的免疫逃避现象,本文主要进行了以下研究:1.PEDV S蛋白高变区(S1_0A)表达载体的构建以带有经密码子优化的PEDV CV777疫苗株和新流行株PEDV SD2014 s基因的重组载体为模板,设计特异性引物PCR扩增PEDV经典株s基因高变区片段(s1_0A^CV777)和流行株s基因高变区片段(s1_0A^SD2014),构建2个表达载体pET-32a-S1_0A^CV777和pET-32a-S1_0A^SD2014;将测序验证正确的PEDV S1_0A蛋白重组表达质粒转化E.coli BL21感受态细胞,采用IPTG诱导2段重组蛋白的表达;并对诱导条件如IPTG浓度、温度进行了优化,确定在IPTG浓度在0.8 mmol/L,37℃条件下重组蛋白表达量较高,并且重组蛋白是以包涵体的形式存在于菌体中。2.免疫新西兰大白兔制备PEDV S蛋白高变区多克隆抗体在最优条件下大量表达重组蛋白,超声波破碎菌体,离心收集包涵体重组蛋白,并采用SDS-PAGE割胶和电洗脱方法纯化包涵体蛋白。将纯化的2段蛋白各免疫3只新西兰大白兔（0.5 mg/只）,另外设置一只兔子为对照组,相同的方法注射PBS。每隔14 d加强免疫1次,共免疫4次;分别于第一次免疫后的第14、28、42、56 d耳部静脉取血,第58 d颈动脉放血后间接ELISA检测抗体水平,6只兔子的抗体滴度都高于1:1 638 400,表明免疫得到的多抗兔血清具有良好的敏感性;免疫组化和免疫荧光显示获得的抗S1_0A^CV777和抗S1_0A^SD2014多克隆抗体都具有很好的特异性。3.PEDV S1_0A^CV777和S1_0A^SD2014线性B细胞表位区筛选设计并合成覆盖PEDV经典株和流行株S蛋白高变区（1-496aa）全长的互有8 aa重叠的系列16肽编码DNA,体外退火后插入到表达载体pXXGST-3中,构建表达载体pXXGST-3-P1^P61,将序列验证正确的重组质粒转化E.coli BL21感受态细胞,分别以抗S1_0A^CV777多抗血清和抗PEDV S1_0A^SD2014多抗血清为一抗Western blot筛选覆盖S1_0A^CV777和S1_0A^SD2014序列全长、彼此重叠8 aa的系列16肽中的阳性反应性16肽。利用抗PEDV S1_0A^CV777多抗血清和抗S1_0A^SD2014多抗血清在PEDV S1_0A^CV777上共鉴定到34个阳性反应性16肽。其中,16个为两种血清共同识别的表位肽,12个为抗PEDV S1_0A^CV777血清特异性识别的表位肽,6个为抗S1_0A^SD2014血清特异性识别的表位肽;利用抗PEDV S1_0A^SD2014多抗血清和抗S1_0A^CV777多抗血清在PEDV S1_0A^SD2014上共筛选到28个阳性反应性16肽,其中,13个为两种血清共同识别的表位肽,12个为抗PEDV S1_0A^SD2014血清特异性识别的表位肽,3个为抗S1_0A^CV777血清特异性识别的表位肽。