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目的:本课题组前期体外实验已经证实短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)能长期有效、稳定的沉默头颈部鳞状细胞癌(head and neck square cell carcinoma,HNSCC)颈淋巴结转移HSC-4细胞FANCD2基因的表达。shRNA干扰沉默HSC-4细胞FANCD2基因表达后,通过调控HSC-4细胞放射治疗后的增殖、凋亡及细胞周期从而提高其对放射治疗的敏感性,并初步阐明了其放疗增敏机制可能与激活p38丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路,并通过调节凋亡相关蛋白Bax、Bcl2的表达有关。本课题在此基础上进一步通过体内动物实验探讨FANCD2 shRNA干扰对HSC-4细胞裸鼠移植瘤的生长及放疗敏感性的影响,并研究其可能存在的机制,为FANCD2成为HNSCC治疗的新靶点提供实验基础和理论依据。方法:以课题组前期实验获得的FANCD2基因沉默效应稳定的HSC-4细胞为研究对象,建立裸鼠皮下移植瘤模型。将15只雌性BALB/c-nu裸鼠编号后按随机数字表法分为三组,每组5只。实验组:FANCD2-shRNA(接种转染FANCD2有效干扰序列且沉默效应稳定的HSC-4细胞),阴性对照组:FANCD2-shRNA-C(接种转染FANCD2无效干扰序列的HSC-4细胞),空白对照组:HSC-4(接种未经任何处理的野生型HSC-4细胞)。通过动物体内实验,观察三组细胞成瘤率、成瘤时间及瘤体生长情况;于HSC-4细胞接种28天后行裸鼠皮下移植瘤瘤体局部常规分割放疗,2Gy/次,1次/天,连续5天,观察放疗后三组瘤体体积变化情况,绘制瘤体体积生长曲线;于放疗结束后的第10天用颈椎脱臼法处死裸鼠,迅速完整剥离瘤体,称取瘤体重量,计算肿瘤抑瘤率;瘤体常规病理HE染色,观察瘤体病理学特点;DNA断裂的原位末端标记法(Terminal-deoxynucleoitidyl Transferase Mediated Nick End Labeling,TUNEL)检测瘤体内肿瘤细胞凋亡情况;免疫组化Envision法(Immunohistochemistry,IHC)及免疫印迹(Western Blot,WB)检测瘤体放疗后Bax、Bcl2、p38和p-p38蛋白表达的变化,探讨FANCD2 shRNA干扰对HSC-4细胞放疗敏感性的影响与Bax、Bcl2、p38和p-p38蛋白表达的关系及其可能存在的机制。结果:(1)HSC-4细胞裸鼠皮下成瘤实验结果显示:三组的15只裸鼠均形成肉眼可见的瘤块,成瘤率100%;与对照组相比,实验组裸鼠皮下移植瘤成瘤时间延长、生长减缓、瘤体体积及重量明显减小。实验组HSC-4细胞成瘤时间为9~10天,中位时间10天;阴性对照组及空白对照组成瘤时间为5~7天,中位时间6天。放疗前实验组瘤体体积为57.88±5.12mm~3,显著低于阴性对照组89.95±7.44mm~3与空白对照组98.83±6.31mm~3(F=56.474,P<0.05);放疗后实验组瘤体体积为11.11±5.25mm~3,显著低于阴性对照组57.96±11.36mm~3与空白对照组67.42±4.40mm~3(F=77.466,P<0.05),且实验组放疗后瘤体体积缩小了46.77±2.76mm~3,显著多于阴性对照组31.41±3.52mm~3与空白对照组31.09±7.69mm~3(F=15.206,P<0.05);放疗后实验组瘤体重量0.034±0.015g显著低于阴性对照组0.092±0.023g与空白对照组0.100±0.045g(F=6.950,P<0.05);实验组瘤体重量抑瘤率为66.00±15.17%,体积抑瘤率为83.52±7.78%;瘤体HE染色见肿瘤细胞成巢状分布,可见环状红染的角化珠和细胞间桥,细胞异形性明显,核分裂象多见,符合鳞癌的病理学特点。(2)TUNEL结果显示:放疗后三组瘤体均有不同程度的凋亡细胞,但实验组凋亡细胞数显著高于阴性对照组与空白对照组;实验组的凋亡指数AI(apoptotic index,AI)为56.02±6.51%,显著高于阴性对照组30.80±4.47%与空白对照组26.22±5.82%(F=80.216,P<0.05)。(3)IHC结果显示:放疗后,实验组较对照组Bax、p-p38蛋白表达显著增加,Bcl2、p38蛋白表达显著降低;实验组Bax蛋白的平均光密度(mean optical density,MOD)值为0.190±0.022,显著高于阴性对照组0.168±0.015与空白对照组0.163±0.012(F=6.594,P<0.05);实验组p-p38蛋白的MOD值为0.224±0.015,显著高于阴性对照组0.173±0.016与空白对照组0.165±0.015(F=20.778,P<0.05);实验组Bcl2蛋白的MOD值为0.147±0.013,显著低于阴性对照组0.176±0.012与空白对照组0.168±0.008(F=16.137,P<0.05);实验组p38蛋白的MOD值为0.161±0.016,显著低于阴性对照组0.191±0.010与空白对照组0.200±0.029(F=15.330,P<0.05)。(4)WB结果显示:放疗后,实验组较对照组Bax、p-p38蛋白表达显著增加,Bcl2、p38蛋白表达显著降低;实验组Bax蛋白的灰度值为0.219±0.008,显著高于阴性对照组0.089±0.005与空白对照组0.091±0.005(F=6.594,P<0.05);实验组p-p38蛋白的灰度值为0.129±0.005,显著高于阴性对照组0.020±0.004与空白对照组0.024±0.004(F=652.917,P<0.05);实验组Bcl2蛋白的灰度值为0.053±0.005,显著低于阴性对照组0.097±0.013与空白对照组0.105±0.008(F=25.200,P<0.05);实验组p38蛋白的灰度值为0.021±0.002,显著低于阴性对照组0.215±0.007与空白对照组0.233±0.006(F=1314.201,P<0.05)。结论:(1)FANCD2 shRNA干扰延长了HSC-4细胞在裸鼠体内的成瘤时间,并抑制HSC-4细胞在裸鼠体内的生长;(2)FANCD2 shRNA干扰降低了放疗后裸鼠HSC-4细胞移植瘤瘤体的体积和重量,增加了放疗后裸鼠HSC-4细胞的抑瘤率,促进了放疗引起的HSC-4细胞凋亡,即在活体内FANCD2 shRNA干扰提高了HSC-4细胞对放疗的敏感性;(3)FANCD2 shRNA干扰对裸鼠HSC-4细胞移植瘤的放疗增敏机制与激活p38 MAPK信号通路,并通过调控凋亡相关蛋白Bax、Bcl2的表达有关;(4)FANCD2有望成为HNSCC治疗的新分子靶点,并且FANCD2 shRNA干扰为临床HNSCC的靶向治疗提供了新的思路。