论文部分内容阅读
目的:（1）运用气血理论探讨冠脉微循环障碍的发病机理及益气活血药物对冠脉微循环障碍的防治作用;（2）探究益气活血药物天香丹对冠脉微循环障碍大鼠模型及冠脉微血管内皮细胞损伤模型的干预作用;（3）介导Nrf2/ARE通路探讨天香丹对微血管炎症及内皮功能的作用机制,以探索天香丹治疗冠脉微循环障碍的新机制。方法:（1）（1）系统梳理中医经典古籍、气血理论相关书籍及文献,阐述气血理论内涵,并在气血理论指导下论述冠脉微循环障碍的病因病机及益气活血药物对冠脉微循环障碍的防治作用;（2）从中英文数据库检索益气活血药物联合西药治疗冠脉微循环障碍的临床随机对照试验相关文献进行Meta分析。（2）（1）在SD大鼠左心室内注射月桂酸钠建立冠脉微循环障碍（CMD）模型,并将大鼠分为假手术组、CMD模型组、天香丹低剂量组、天香丹中剂量组、天香丹高剂量组及尼可地尔组,给予低、中、高剂量的天香丹、尼可地尔等干预处理;（2）检测心功能,观察心肌组织微血管结构变化,观察天香丹对CMD大鼠心功能及冠脉微血管结构的影响;（3）检测血清一氧化氮（NO）、内皮素-1（ET-1）水平及心肌组织内皮型一氧化氮合酶（eNOS）蛋白表达水平,评价天香丹对CMD大鼠内皮功能功能的影响;（4）用脂多糖（LPS）诱导人冠脉微血管内皮细胞（HCMECs）损伤建立HCMECs损伤模型,分为对照组、脂多糖组（LPS,10μg/ml）、天香丹组（TXD,50μg/ml）、脂多糖与天香丹共处理组（LPS+TXD）;（5）检测细胞活力、细胞eNOS蛋白的表达水平及上清液NO、LDH水平、单层微血管内皮细胞通透性以评价天香丹对冠脉微血管内皮细胞的保护作用;（6）检测血清炎症因子及心肌组织TNF-α、NF-κB、Nrf2的表达水平,评价天香丹对CMD大鼠炎症损伤的保护作用;（7）检测细胞上清炎症因子及细胞内ROS、Nrf2、NF-κB表达水平,评价天香丹对HCMECs炎症损伤的保护作用。（3）（1）检测CMD大鼠心肌组织Nrf2/ARE通路和IKKβ/IκBα/NF-κB通路相关因子m RNA及蛋白表达情况;（2）在Nrf2抑制剂（ML385）的作用下检测HCMECs中以上指标的m RNA及蛋白表达情况探索天香丹对冠脉微血管炎症的改善机制;（3）通过检测HCMECs中eNOS蛋白表达情况及细胞存活率,探究天香丹对微血管内皮细胞的保护机制。结果:（1）对冠脉微循环障碍发病机理及防治的中医理论探索:（1）气虚血瘀是冠脉微循环障碍最主要病机,心气虚及心络气血不通是导致“气血失调”的关键因素,治疗以“益气活血”法为要。现代药理学研究显示益气活血药物可通过改善内皮功能、调节能量代谢、抑制炎症、抑制微血栓形成等作用改善冠脉微循环障碍。（2）Meta分析的结果显示,相比于单纯西药治疗冠脉微循环障碍,益气活血药物联合治疗可更好的改善CMD临床疗效,改善心电图表现及中医证候表现,降低C反应蛋白及ET-1水平。（2）益气活血药物天香丹对冠脉微循环障碍的防治作用:（1）天香丹对CMD大鼠心功能及心肌微血管病理结构的影响:与CMD组相比,天香丹中、高剂量组左室射血分数值增高（P＜0.05）,且微血管血栓减少,血管壁的水肿改善,血管周围炎性细胞浸润程度降低,微血管内皮细胞内质网肿胀、基底膜断裂、心肌纤维及心肌细胞线粒体结构破坏等超微结构损伤得到改善;微血管密度也明显升高（P＜0.05）。（2）天香丹对CMD大鼠内皮功能功能的影响:与CMD组相比,天香丹中、高剂量组血清NO水平及NO/ET-1的比值明显升高（P＜0.05）,心肌组织eNOS蛋白水平升高（P＜0.05）,与尼可地尔组相比无统计学差异（P＞0.05）。（3）天香丹对LPS诱导损伤的HCMECs的保护作用:与LPS组相比,用LPS+TXD组HCMECs存活率明显增高（P＜0.01）,细胞内eNOS蛋白表达水平及上清液NO水平增加,LDH释放量减少（P＜0.05）。（4）天香丹对冠脉微血管炎症的影响:动物水平上,与CMD组相比,天香丹低、中、高剂量组血清IL-1β、TNF-α水平及高剂量组IL-6水平均降低（P＜0.05）;此外,天香丹中、高剂量组心肌组织TNF-α水平及低、中、高剂量组p65表达水平降低（P＜0.05）,中、高剂量组Nrf2表达水平明显升高（P＜0.05）,以高剂量组更为明显。细胞水平上,与LPS组相比,LPS+TXD组细胞上清IL-1β、TNF-a及细胞内ROS表达水平明显降低（P＜0.05）,且细胞核内Nrf2的荧光强度增强,而NF-κB的荧光强度减弱。（3）天香丹介导Nrf2/ARE通路对冠脉微血管炎症及内皮功能的改善机制:（1）动物水平上,与CMD组相比,天香丹可升高Nrf2、HO-1、IκBα的m RNA及蛋白表达水平（P＜0.05）;而降低NF-κB p65的m RNA水平,IKKβ、IL-1β、TNF-α的蛋白水平及p65磷酸化蛋白的表达水平（P＜0.05）。（2）在细胞水平上,使用Nrf2抑制剂前,与LPS组相比,LPS+TXD组Nrf2、HO-1及IκBα的m RNA表达水平及Nrf2、HO-1蛋白表达水平均升高（P＜0.05）,同时NF-κB p65 m RNA及其磷酸化蛋白表达水平降低（P＜0.05）;使用Nrf2抑制剂后,天香丹对IκBα的促表达作用及对NF-κB p65磷酸化的抑制作用均部分抵消,对IL-1β及TNF-α的抑制作用被削弱,HCMECs的存活率降低。但天香丹对eNOS的促表达作用无明显减弱。结论:（1）用气血理论看冠脉微循环障碍,心气不足和心络气血痹阻是导致其“气血失调”的关键原因,气虚血瘀是其最主要病机,而益气活血为重要治疗原则。相关基础与临床研究显示,益气活血药物具有改善冠脉微循环障碍的效果。（2）益气活血药物天香丹对冠脉微循环障碍大鼠心肌微血管结构损伤及微血管内皮功能具有改善作用,并减轻冠脉微循环障碍大鼠及微血管内皮细胞的炎症损伤。（3）天香丹可介导Nrf2/ARE通路调控IκBα/NF-κB通路,从而抑制冠脉微血管炎症损伤,保护微血管内皮细胞,改善冠脉微循环障碍。