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目的:研究中等棘状神经元乙酰胆碱能M4受体对Cdk5/DARPP-32 Thr75信号通路的调控作用及M4/Cdk5/DARPP-32 Thr75信号通路在维持纹状体Ach-DA平衡机制。方法:（1）NF和GAD免疫标记中等棘状神经元,对其进行荧光染色鉴定;应用激光共聚焦技术研究mAChRs受体亚型在中等棘状神经元亚细胞定位与表达。Lipofectamine3000包被shRNA慢病毒颗粒,于转染24,48,72,96 h在荧光显微镜下观察病毒GFP表达。（2）应用激光共聚焦技术观察M4受体、M1受体与Cdk5共定位表达情况;应用活细胞实时钙成像检测在给予不同浓度(10-6,10-4,10-2 mol/L)Oxo-M处理后,神经元胞质钙离子浓度的变化;分别使用M1受体拮抗剂MT7(10-7 mol/L),M4受体拮抗剂MT3(10-7 mol/L)预处理,应用蛋白免疫印迹法与免疫荧光观察Oxo-M诱导Cdk5及p35/25的表达变化。（3）应用蛋白免疫印迹法与免疫荧光观察在KD-M4 MSNs模型上或给予Cdk5抑制剂预处理后对Oxo-M诱导Cdk5的表达及DARPP-32 Thr75磷酸化状态的改变;应用荧光共振能量转移检测非选择性多巴胺受体激动剂APO诱导中等棘状神经元cAMP的含量变化;Oxo-M(10-6 mol/L)预处理5 min后,与APO(10-6 mol/L)共孵育10min,应用激光共聚焦和免疫蛋白印迹技术检测DARPP-32 p-Thr34水平。结果:（1）纹状体神经元培养至第7天,神经元发育成熟,中等棘状神经元含量较高。经免疫荧光结果,M4受体与M1受体表达量较高,两者主要分布于细胞膜与细胞质。shRNA病毒颗粒（MOI=20）经转染96 h,Chrm4-shRNA病毒GFP表达较高,MSNs上M4受体被敲减。（2）与对照组相比,10-66 mol/L Oxo-M处理MSNs 15 min可显著上调Cdk5（p<0.01）与p35/25的表达（p<0.01）;在中等棘状神经元中,M4受体与Cdk5存在明显共定位分布,而M1受体与Cdk5无明显共定位分布;活细胞钙成像结果显示:仅当Oxo-M浓度在10-4和10-2 mol/L时可观察钙离子浓度上调,当Oxo-M浓度为10-8和10-6 mol/L范围时未观察到钙离子浓度上调。MT7(10-5 mol/L)预处理组,显著抑制胞内钙离子浓度;蛋白免疫印迹结果显示:与对照组相比,10-6 mol/L Oxo-M处理中等棘状神经元15 min可显著上调Cdk5（p<0.01）与p35/25的表达（p<0.01）;与Oxo-M组相比,给予M4受体拮抗剂MT3预处理细胞,Cdk5与p35/25的表达均被抑制（p<0.01）。给予M1受体拮抗剂MT7预处理细胞,Cdk5表达无显著改变。（3）与正常MSNs相比,给予Oxo-M(10-6 mol/L)处理KD-M4 MSNs 15 min,Cdk5（p<0.01）与DARPP-32 Thr75磷酸化（p<0.01）均被抑制;与Oxo-M组相比,Rosc(10-5mol/L)预处理MSNs,显著抑制Oxo-M诱导Cdk5（p<0.001）和DARPP-32 Thr75的磷酸化（p<0.001）;给予中等棘状神经元非选择性多巴胺受体激动剂APO（10-22 mol/L）处理1 min,cAMP含量显著升高,给予D1受体阻断剂SKF23390,APO诱导cAMP显著含量降低。使用Oxo-M(10-6 mol/L)预处理5 min后,与APO(10-6 mol/L)共孵育10 min,与单独给予对照组相比,Oxo-M+APO联合给药组DARPP-32 p-Thr34显著降低（p<0.01）。结论:中等棘状神经元乙酰胆碱能M4受体特异性调控Cdk5及p35/25的表达。且M4/Cdk5/DARPP-32 Thr75信号通路的激活抑制APO诱导DARPP-32 Thr34磷酸化水平。