鸡白痢沙门氏菌常规和实时荧光定量PCR检测方法的建立

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鸡白痢是由鸡白痢沙门氏菌引起的危害养禽业的细菌病之一,严重影响着我国禽养殖业的健康发展,并且被列为国家规定净化的细菌病。目前,最有效的防控措施是加强对鸡群的检疫、及时淘汰感染鸡只,逐步达到净化鸡群的目的。因此,建立一种快速、准确的检测方法对于鸡白痢的净化工作有着重要意义。本研究中,通过对Gen Bank登录的菌株号为ATCC 9120的鸡白痢沙门氏菌全基因组进行全面生物信息学分析,与NCBI数据库中其他菌属的基因组比较,筛选出了鸡白痢沙门氏菌基因组中的一段基因号为SEEP9120017695的保守序列,该基因为鸡白痢沙门氏菌的特有基因,因此确定其为检测鸡白痢沙门氏菌的靶基因。根据选出的靶点基因设计了11对候选引物,使用33株沙门氏菌和11株非沙门氏菌以PCR方法分别验证各对引物的特异性,最终筛选出了一对特异性最好且扩增条带大小(219 bp)适合进行荧光定量PCR的引物,经PCR条件优化后建立了一种常规PCR检测方法。对所建立方法的灵敏度进行检验,其检测鸡白痢沙门氏菌基因组时,灵敏度可达2.13 pg/μL;检测细菌纯培养物时灵敏度为2.1×104 cfu/mL。以该方法对人工污染鸡白痢沙门氏菌的鸡粪、鸡蛋和鸡肉进行检测,对于轻度污染(13 cfu/10g样品)的样品,只需要对样品增菌培养68小时便可检出;增菌培养2 h便可检测严重污染(1.3×107 cfu/10 g样品)的样品。但是在检测鸡蛋样品时需适当增加12小时的增菌时间便可有效检出阳性样品。根据常规PCR方法的反应条件,建立了SYBR荧光定量PCR方法。依据特异性评价实验结果中44个菌株的扩增曲线和熔解曲线,分析可知该方法检测鸡白痢沙门氏菌时的特异性好。建立的SYBR荧光定量PCR方法检测鸡白痢沙门氏菌基因组的灵敏度为34 fg/μL。使用鸡白痢沙门氏菌分别污染鸡粪、鸡蛋、鸡肉,建立人工污染样品,同时使用本研究建立的SYBR荧光定量PCR方法和标准细菌分离鉴定的方法对污染样品进行检测,评价本方法的检测效果。当鸡白痢沙门氏菌的初始污染量低至2 cfu/10 g鸡粪或鸡肉时,经过6 h对样品的振荡培养,荧光定量PCR方法阳性检出率为24/27(88.9%),与标准方法检测的符合率为100%;当以2 cfu/10 mL的初始接种量污染鸡蛋时,6 h后荧光定量PCR方法的阳性检出率为21/27(77.8%),与标准方法检测的符合率为91.7%。本研究筛选到一个鸡白痢沙门氏菌特有的基因作为检测用的靶基因,并以此建立了常规PCR和实时荧光定量PCR检测方法,两种方法在实际检测中各有优势,常规PCR检测方法简便、经济,而荧光定量PCR检测方法具有灵敏度更高、检测更准确的特点,实际检测过程中可以考虑实际情况对两种方法进行选择。本研究为家禽养殖业提供了快速诊断鸡白痢的技术手段,也为实验室今后对鸡白痢沙门氏菌的鉴别检测提供了研究基础。
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