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目的：分别通过直接法和预定位方法利用99TCm标记抗胃泌素释放肽前体（ProGRP）单克隆抗体D-D3，并对比研究这两种不同方法的标记产物在正常裸鼠和人小细胞肺癌荷瘤裸鼠体内的分布情况及显像效果，进一步探讨通过预定位技术标记的抗胃泌素释放肽前体单克隆抗体显像是否可以作为早期诊断小细胞肺癌的最佳途径。方法：1.生物素化单抗D-D3的制备及检测将抗胃泌素释放肽前体单克隆抗体D-D3溶于碳酸氢钠溶液、生物素活化酯溶于无水二甲基亚砜（DMSO）中，按生物素活化酯与抗体的质量比为8:1在室温下放置3~4h，用SephadexG50层析柱进行纯化。分别采用HABA/Avidin试剂盒、细胞ELISA法对抗体的生物素化程度及其活性进行测定；ELISA法检测生物素化抗体的效价；并以生物素化单克隆抗体D-D3为一抗，用免疫组化法检测靶组织的ProGRP蛋白表达。2. DTPA-生物素及单抗D-D3的99Tcm标记及检测2.1放射性核素99Tcm标记生物素：将DTPA-生物素用0.05mol/L的PBS溶解，加入浓盐酸配制的氯化亚锡溶液中，再加入一定量的99TcmO4-，室温下振摇均匀。标记时分别改变不同标记体积和加入不同量的亚锡以摸索最佳标记条件，纸层析法测不同标记条件下的标记率；将标记产物分别与生理盐水及正常人血清混合后置于37℃水浴箱，分别在不同时间点测定放化纯以了解其稳定性。2.299Tcm直接法标记D-D3：采用2-巯基乙醇还原法制备标记99Tcm-D-D3，凝胶柱分离法纯化标记产物，纸层析法检测标记率、放化纯并了解其稳定性，利用细胞结合分析法测定99Tcm-D-D3的免疫活性。3.标记抗体在正常裸鼠和荷瘤裸鼠体内的分布研究正常裸鼠采用三步法预定位技术给药，首先自尾静脉注射生物素化抗体200μg；1天后注射200μg亲和素；第3天注入99Tcm-DTPA-生物素0.148MBq（0.004mCi），于不同时间点采取颈椎脱臼法处死裸鼠，取其血液及各主要脏器组织标本，计算不同时间点的每克组织注射百分剂量比（%ID/g）。建立小细胞肺癌荷瘤裸鼠模型，分为预定位组和直接法标记组。预定位组包括A组：首先自尾静脉注射生物素化抗体200μg；1天后注射200μg亲和素；第3天注入99Tcm-DTPA-生物素0.148MBq（0.004mCi）。B组：第1天注射不含抗体的生物素，其余同A组。C组：第1、2天均注射生理盐水，其余同A组。直接法标记组即D组：直接注射99Tcm-D-D30.148MBq（0.004mCi）。各组裸鼠于不同时间点采取颈椎脱臼法处死裸鼠，取其血液及各主要脏器组织标本，计算不同时间点的%ID/g和瘤体/非瘤体组织放射性计数（T/NT）比值。4.正常裸鼠和小细胞肺癌荷瘤裸鼠体外预定位显像研究注射上述99Tcm标记产物后，对正常裸鼠及小细胞肺癌荷瘤裸鼠模型进行SPECT/CT静态显像，观察两种不同方法的标记产物的显像效果，利用ROI技术在不同时相的荷瘤裸鼠显像图上勾画移植瘤轮廓，并计算瘤体与对侧相同部位的比值（T/B值）。结果：1.活性生物素酯与抗体的质量比为8:1的条件下，生物素化单抗中生物素/D-D3摩尔比为2.5:l，其免疫活性分数为90.92%。2.99Tcm-DTPA-生物素标记率为88.50±1.04%，放化纯为89.45±0.24%；与生理盐水混合在37℃水浴箱放置8h后99Tcm-D-D3放化纯为65.46±1.86%，12h后放化纯为58.54±0.25%；与正常人血清充分混合在37℃水浴箱放置8h后99Tcm-DTPA-生物素放化纯70.36±1.46%，12h后放化纯为60.81±1.01%。99Tcm-D-D3标记率为78.69±3.11%，放化纯为92.14±3.55%；与生理盐水混合在37℃水浴箱放置8h后99Tcm-D-D3放化纯64.73±0.34%，12h后放化纯为54.45±0.95%；与正常人血清充分混合在37℃水浴箱放置8h后99Tcm-D-D3放化纯65.49±0.45%，12h后放化纯为52.92±0.84%，其免疫结合率为82.1±2.45%。3.99Tcm-DTPA-生物素在采用三步法预定位技术给药的正常裸鼠体内的分布符合一级血药动力学二室模型，主要通过肝脏、肾脏代谢，血液清除速度快，肌肉及脑组织摄取不明显。小细胞肺癌荷瘤裸鼠A组肿瘤迅速摄取99Tcm-DTPA-生物素并且血本底较低，达到较高瘤/血比值；未经抗体预定位的B组虽然血液清除较快，但肿瘤内摄取值较低；直接注99Tcm-DTPA-生物素的C组由于缺少抗体预定位作用及生物素-亲和素的放大作用，血液内和肿瘤内的值相近，肿瘤内仅为本底水平。99Tcm直接法标记D-D3抗体的D组，达到较高的瘤/血比值需较长时间。4.放射免疫显像结果显示：99Tcm-DTPA-生物素在正常裸鼠各脏器的聚集情况与体内分布结果相一致。B、C两组荷瘤裸鼠模型的移植瘤部位均未出现明显的放射性浓聚征象，显像结果为阴性。A组荷瘤裸鼠模型的移植瘤于注射99Tcm-DTPA-生物素4h后清晰显影。D组荷瘤裸鼠模型随时间延长移植瘤部位放射性浓聚程度逐渐增强，至8h时移植瘤显影明显。结q论：1.单克隆抗体D-D3在结合一定数量的生物素分子后，仍可保持较高的免疫活性。2.影响生物素99Tcm标记率的主要因素为亚锡含量，同时标记体积及PH也会影响标记结果，标记体积100uL、亚锡用量5ug、pH7.4的标记体系为最佳标记条件。99Tcm-DTPA-生物素与99Tcm-D-D3在体内、外均保持较好的稳定性。3.预定位技术对肿瘤有特异性增强作用和信号放大效应，可提高靶瘤内99Tcm的浓聚，优于抗体直接标记法，为分子免疫显像提供了新途径。