由于临床上唑类抗真菌药物(尤其是氟康唑)的广泛和长期使用以及部分药物的滥用,导致了白念珠菌对氟康唑产生了严重的耐药性,这也是目前临床中使用氟康唑治疗白念珠菌感染失败的首要原因。白念珠菌耐药性的获得是多基因在多层级水平变异和积累的复杂过程,而抗真菌药物之间的联合用药已成为抗真菌感染治疗及降低耐药性产生的重要途径之一。本课题组前期实验表明氟康唑和盐酸小檗碱联合用药具有显著的协同抗耐药真菌作用,而对敏感真菌没有协同作用。为明确对氟康唑敏感或耐药的白念珠菌胞内氟康唑含量的差异,及是否因白念珠菌胞内氟康唑含量的变化而使氟康唑对不同真菌发挥不同的抗真菌治疗作用,同时考察氟康唑和小檗碱的协同抗耐药真菌作用是否依赖于真菌胞内氟康唑含量的增加,本研究建立了使用液相色谱-质谱／质谱联用(LC-MS/MS)测定白念珠菌胞内氟康唑含量的方法。通过使用LC-MS/MS法对氟康唑(FLC)耐药的白念珠菌103菌和100菌进行48h胞内氟康唑含量监测,以上两株白念珠菌胞内氟康唑含量均在24～36h时达到最大值。在本研究中,随机选用36株白念珠菌临床菌,分别检测其对氟康唑的药物敏感性及氟康唑作用后1h胞内的氟康唑含量,结果显示：白念珠菌对氟康唑的敏感性与其胞内的氟康唑含量相关,白念珠菌敏感菌胞内氟康唑含量显著高于耐药菌胞内氟康唑含量。本研究还通过LC-MS/MS去检测了氟康唑与小檗碱等中药单体化合物、中药提取物,以及其它临床常用抗真菌药物联合用药后白念珠菌胞内氟康唑含量变化情况,盐酸小檗碱与氟康唑合用呈协同抗耐药真菌作用,但可以显著降低胞内的氟康唑含量,其他具有协同抗耐药真菌作用的中药单体化合物却不影响白念珠菌胞内氟康唑含量；而在中药提取物中,月季花提取物可以显著升高胞内的氟康唑含量,并与氟康唑合用具有协同抗耐药真菌作用,其他具有协同抗耐药真菌作用的中药提取物也不影响白念珠菌胞内氟康唑含量；与氟康唑合用呈协同或相加作用的临床常用抗真菌药物咪康唑、卡泊芬净、特比奈芬可以显著降低胞内的氟康唑含量。上述结果表明,不同药物和中药与氟康唑的协同抗耐药真菌作用不完全依赖于真菌胞内氟康唑含量的增加,尤其是小檗碱不仅没有增加,反而降低了真菌胞内氟康唑含量。因此本研究还通过LC-MS/MS法检测了盐酸小檗碱与氟康唑合用后,白念珠菌胞内盐酸小檗碱含量的变化情况,以及与临床常用抗真菌药物合用后白念珠菌胞内的盐酸小檗碱含量变化情况。结果显示,氟康唑可以显著增加白念珠菌胞内盐酸小檗碱的含量：另外,咪康唑和卡泊芬净也能增加白念珠菌胞内盐酸小檗碱的含量,咪康唑与盐酸小檗碱具有协同抗耐药真菌作用,而卡泊芬净与盐酸小檗碱合用表现为无关。另外,本课题组前期实验发现并经本研究证实,4μg/mL氟康唑在与不同浓度盐酸小檗碱合用时,与20盐酸小檗碱合用组的抗真菌作用最强,当小檗碱浓度进一步增加时,其抗真菌作用反而减弱。本研究结果表明,20盐酸小檗在对胞内氟康唑含量的影响最小综上所述,氟康唑作用后,白念珠菌胞内的氟康唑含量与其对氟康唑的敏感性具有一定的相关性：与氟康唑耐药菌相比,氟康唑敏感菌胞内的氟康唑含量更高。氟康唑与盐酸小檗碱对耐药真菌的协同作用,是通过增加真菌胞内的盐酸小檗碱含量,而不是增加氟康唑含量来实现的。本课题组前期研究发现,小檗碱可促进CDR1、MDR1等药物外排泵基因的表达,并且与氟康唑单用比,氟康唑和盐酸小檗碱合组对罗丹明6-G的外排增加。因此,本研究发现与盐酸小檗碱合用后,氟康唑在真菌胞内的含量下降可能与盐酸小檗碱促进药物外排泵,增加氟康唑外排有关。与其它药物联合用药的研究结果表明,白念珠菌胞内氟康唑或盐酸小檗碱的含量变化并不是其发挥协同抗耐药真菌的唯原因,可能存在其它作用靶点或调控通路上的变化而发挥协同抗耐药真菌作用。