细胞核是细胞遗传与代谢的控制中心,调控细胞对外界的响应、代谢、生长和分化等细胞活动。有研究发现,在细菌感染宿主细胞过程中,个别细菌来源的效应蛋白能够靶向进入宿主细胞核,影响细胞核内基因的转录、RNA剪切、DNA修复以及染色质重组等生命活动。该课题旨在通过核定位信号肽筛选可以靶向进入宿主细胞核的细菌蛋白,并对其调控机制做初步探究,为深入探究病原细菌对感染宿主细胞的致病机理提供理论基础。首先通过核定位信号肽筛选出了7个来自病原菌的潜在入核蛋白,将这7个基因序列构建至带有绿色荧光蛋白的p EGFP-N1载体上,转染至293T细胞内,在荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白的细胞亚定位,发现来自小肠结肠炎耶尔森氏菌的RovA蛋白可靶向宿主细胞核内。随后通过扫描激光共聚焦再次验证了RovA蛋白可靶向宿主细胞核内,并且RovA87-92AKRIKL对于其入核至关重要。在确定了RovA靶向宿主细胞核后,通过ChIP-seq（免疫共沉淀与测序相结合）技术初步探索了RovA蛋白进入宿主细胞核后与哪些DNA相结合。首先构建p ECMV-3×Flag-rov A融合蛋白表达载体,并利用Ch IP-seq技术筛选到21个DNA序列与RovA蛋白结合,进一步构建了带有His标签的p ET-28a-rov A载体,纯化RovA蛋白,利用凝胶电泳迁移（EMSA）方法体外验证得到了3个DNA序列与RovA蛋白存在结合,距离该3个DNA片段峰位置中点最近的起始转录位点所对应的基因分别为ENSG00000201178.1、ENSG00000238129.1及ENSG00000264970.1。此外,利用免疫共沉淀及质谱鉴定技术探索了在细胞内与RovA互作的蛋白,初步解析RovA入核机制。质谱鉴定的结果发现有7个核转运蛋白。对该7个蛋白进行功能性分析以及Blast比对,筛选后纯化P52292、Q14974、O00629和Q5TFJ7这4个蛋白。进一步采用表面等离子共振和微量热泳动仪体外验证RovA蛋白与该4个蛋白是否存在互作,结果表明RovA蛋白与该4个蛋白均存在结合,其亲和力依次为2.5836×10-6M、5.2276×10-7M、3.4955×10-6M以及1.218×10-5M,由亲和力可以看出,RovA蛋白与Q14974（Importinβ1）结合最强。可以初步推测RovA可能是由该四个转运蛋白与其核定位信号肽（AKRIKL）相结合,在其介导下靶向进入宿主细胞核。