偏头痛是一种严重的神经血管性疾患,临床常见为单侧搏动性头痛并伴有畏光、声、某气味,恶心,自主、认知、情感和运动障碍等症状。目前,偏头痛的发病机制并不完全清楚,主要存在以下几种学说:神经源学说、血管源学说、三叉神经血管源学说、生化因素、遗传因素等。抗偏头痛药物研发已取得较大进展,现存药物包括非甾体抗炎类、麦角类、曲坦类和阿片类药物;另外多种多巴胺受体拮抗剂、硫酸镁以及一些天然药物等也被应用于偏头痛的治疗。但这些药物仍存在诸多不足,急需研发新型抗偏头痛药物。中药应用于疼痛治疗已有数千年历史,疗效确切及毒副作用小等优点已使中药成为镇痛药物研发的热点之一。元胡止痛方是中国临床常用的止痛方剂,其组方药物为延胡索和白芷两味药材;中国药典规定其指标性成分为延胡索乙素(多巴胺D2受体拮抗剂)。目前有研究将元胡止痛方应用于偏头痛的治疗,并取得了良好的疗效。然而,元胡止痛方治疗偏头痛的功效成分和作用机制并不清楚。在中医理论指导下,中医临床用药常用复方。中药复方化学成分非常复杂,其中何种成分为有效成分一直是广大中药研究工作者探寻之目标。药物只有通过与人体相互作用才能发挥药效,人体口服中药后,其复杂成分中,只有进入血液循环,并到达相应靶器官的成分才有可能是具有相应药理作用的活性成分。因此,本研究系统地运用了药物分析、药代动力学、组织分布,动物行为学和分子生物学等研究手段对元胡止痛方进行了体内外研究,旨在探讨和阐明元胡止痛方治疗偏头痛的功效成分和作用机制,为揭示元胡止痛方的组方原理和创制高效低毒、成分明确的治疗偏头痛药物奠定基础。1实验目的1.1建立元胡止痛方多成分分析方法,以确定其主要化学成分。1.2建立元胡止痛方在大鼠血浆和脑组织中的成分分析方法,考察其进入血液和脑组织的主要化学成分,并考察这些成分药代动力学参数和脑组织分布特性。1.3初步阐释元胡止痛方及其主要成分组方延胡索乙素和欧前胡素对大鼠硝酸甘油型偏头痛模型的作用机制。2实验方法2.1元胡止痛方主要化学成分研究2.1.1元胡止痛方制样方法通过考察50%、75%、95%甲醇水溶液对元胡止痛方成分的提取效率,确定最终制样所用提取溶剂浓度。2.1.2元胡止痛方成分分析方法采用HPLC法分析元胡止痛方的化学成分。条件:Phenomenex Luna-C(18)column(250×4.6 mm,5.0μm)色谱柱;流动相:乙腈(Acetonitrile,AC);0.1%磷酸三乙胺水溶液,p H5.6(Phosphoric acid,triethylamine,p H5.6;PT5.6);梯度洗脱程序:0~15 min,23%AC;15~26 min,23~40%AC;26~65 min,40~65%AC;进样量:10μL;检测波长:280 nm;流速:1 m L/min;柱温:30℃。2.2元胡止痛方大鼠体内成分分析2.2.1元胡止痛方提取物制备方法同“元胡止痛方主要化学成分研究”制样方法。2.2.2大鼠血浆和脑组织样品制备方法大鼠灌胃元胡止痛方提取物后0,0.5,1,2,3,4,5,6,7,8,10,12 h,通过眼底静脉丛取血约0.4 m L于肝素抗凝管中抗凝,抗凝后置于4°C低温离心机3500 r/min离心10 min后即得样品。大鼠灌胃元胡止痛方提取物后0,2,4,6,8,10 h迅速断头取脑,将其置于冰盘上,分离为大脑皮层(Cortex,Cor)、小脑(Cerebellum,Cer)、脑干(Brainstem,Bra)、间脑(Diencephalon,Die)、纹状体(Striatum,Str)、海马(Hippocampus,Hip)等6部分。称重后,以1:5比例加入0.9%生理盐水,用高通量组织匀浆器匀浆;所得组织匀浆置于4°C低温离心机离心机中,12000 r/min离心10 min,取上清液于离心管中。2.2.3大鼠血浆和脑组织样品预处理方法准确吸取大鼠血浆、脑组织匀浆200μL于玻璃离心管中,加入20μL内标液混匀,2 m L乙酸乙酯-石油醚(1:1),涡旋混和5 min,2000 r/min离心10 min,所得萃取液置于洁净的玻璃离心管中,氮吹仪中40°C吹干即得待测样品。2.2.4大鼠血浆样品分析方法采用HPLC法分析预处理样品。条件:Phenomenex Luna-C(18)column(250×4.6 mm,5.0μm)色谱柱;流动相:AC:PT5.8(51:49);进样量:20μL;检测波长:血浆280 nm,脑组织230 nm;流速:1 m L/min;柱温:30℃。2.3元胡止痛方治疗偏头痛行为学研究2.3.1机械刺激方法采用Von Frey机械测痛纤维丝,利用不同重量的纤毛压力,按压力从低到高顺序作用于大鼠右侧后肢脚掌中心部,引起大鼠的缩爪反应,以引起50%缩爪反应(作用5次,引起3次缩爪反应)的纤毛压力表示大鼠的机械痛阈值。2.3.2热刺激方法利用辐射热刺激仪作用于大鼠右侧后肢足底皮肤与玻璃板紧密接触部,引起大鼠的缩爪反应,以引起缩爪反应的所需时间表示大鼠的热痛阈值。2.4元胡止痛方对硝酸甘油型偏头痛大鼠血中血管活性物质水平的影响采用NO一步法检测元胡止痛方及其主要成分组方等对大鼠血浆中NO含量影响;采用酶联免疫吸附剂测定法(Enzymelinked Immunosorbent Assay,ELISA)分别检测元胡止痛方及其主要成分组方等对大鼠血浆中5-hydroxy tryptamine(5-HT)、Calcitonin gene related peptide(CGRP)、Histamine(HIS)的含量的影响。2.5元胡止痛方对硝酸甘油型偏头痛大鼠脑中活性成分水平的影响分别采用Western Blot和免疫荧光染色法观察元胡止痛方及其主要成分组方等对大鼠中脑导水管周围灰质腹外侧区尾段中c-Fos,5-HT、CGRP、神经型一氧化氮合酶(n NOS)的影响。3实验结果3.1元胡止痛方主要化学成分研究建立的HPLC法能够有效分离元胡止痛方4种剂型中大部分成分,并定量分析了其中的12种成分,包括原阿片碱(Protopine,PTP)、别隐品碱(α-Allocryptopine,AYE)、黄连碱(Coptisine,CTE)、花椒毒酚(Xanthotol,XTL)、巴马汀(Palmatine,PME)、去氢紫堇碱(Dehydrocorydaline,DDE)、海罂粟碱(Glaucine,GCE)、延胡索乙素(Tetrahydropalmatine,THP)、四氢小檗碱(Tetrahydroberberine,TDE)、欧前胡素(Imperatorin,IMP)、延胡索甲素(Corydaline,CDE)、异欧前胡素(Isoimperatorin,ISO),其中XTL、IMP、ISO来源于白芷,其余源于延胡索。这12种物质中DDE、GCE,THP,IMP在元和止痛方各制剂中含量较高且较稳定。3.2元胡止痛方大鼠体内成分分析3.2.1血浆成分分析建立的HPLC法能够有效分离元胡止痛方入血的5种主要成分,并对这5种成分进行了药代动力学研究。结果表明,THP和GCE的达峰浓度(Cmax)和曲线下面积(AUC0-∞)高于其他三种成分(P<0.05);在生物碱中,THP和GCE的Cmax、AUC0-∞高于CDE(P<0.05);在香豆素中,IMP的Cmax、AUC0-∞高于ISO(P<0.05)。生物碱的Cmax、AUC0-∞、半衰期(T1/2z)、平均滞留期(MRT0-∞)均高于香豆素,佐证了延胡索为方中君药。结果提示,THP、GCE和IMP有可能为元胡止痛方的最主要活性成分。3.2.2脑组织成分分析入血的5种主要成分均能透过血脑屏障。建立的HPLC法能够有效分离元胡止痛方入脑的5种主要成分,并对这5种成分进行了脑组织分布研究。结果表明,THP和GCE在Cor、Cer、Bra、Die、Stri、Hip中Cmax高于其他3种成分(P<0.05),THP的AUC0-∞最高(P<0.05);各成分在全脑中的分布情况,THP和GCE在Str的AUC0-∞高于脑其他部分(P<0.05);尽管CDE、IMP、ISO无法得到所有参数,但通过已有参数,可以推断THP在脑组织各部分中综合含量最高,IMP的综合含量高于ISO,进一步提示THP和IMP有可能为元胡止痛方治疗偏头痛的最主要的活性成分。3.3元胡止痛方治疗偏头痛行为学研究元胡止痛方及其主要成分组方(THP、IMP)等相对于模型组能够有效改善大鼠的机械刺激疼痛和热刺激疼痛敏感性,其中元胡止痛方作用较主要成分组方持久,而主要成分组方起效较快,且主要成分组方效果优于主要成分单用;多巴胺D2受体激动剂喹吡罗能够反转元胡止痛方及其主要成分组方的作用;3.4元胡止痛方对硝酸甘油型偏头痛大鼠血中血管活性物质水平的影响元胡止痛方及其主要成分组方(THP、IMP)等相对于模型组能够有效的上调大鼠血浆中5-HT的含量,下调NO,CGRP,HIS的含量;喹吡罗能够反转元胡止痛方及其主要成分组方对5-HT,NO,CGRP的作用。3.5元胡止痛方对硝酸甘油型偏头痛大鼠脑中活性物质水平的影响元胡止痛方及其主要成分组方(THP、IMP)相对于模型组能够有效的上调大鼠中脑导水管周围灰质腹外侧区(Ventrolateral periaqueductal gray,VLPAG)尾部5-HT的表达水平,下调c-fos,CGRP,n NOS的表达水平;喹吡罗能够反转元胡止痛方及其主要成分组方对c-fos,5-HT,CGRP,n NOS的作用。4研究结论4.1建立的高效液相色谱分析方法适用于元胡止痛方的大鼠体内、外成分分析。结合本人硕士期间研究结果,进一步确定THP和IMP可能为元胡止痛方的主要活性成分,为元胡止痛方有效成分进一步研究奠定了基础。4.2首次证实元胡止痛方及其主要成分组方组(THP、IMP)可能主要通过中枢多巴胺D2受体发挥作用,有效上调硝酸甘油型偏头痛大鼠颈静脉血中5-HT,并下调NO,CGRP,HIS的含量,上调硝酸甘油型偏头痛大鼠VLPAG尾部5-HT,并下调c-Fos,CGRP,n NOS等偏头痛相关分子水平,有效改善大鼠硝酸甘油型偏头痛模型的痛敏增强,以达到治疗大鼠硝酸甘油型偏头痛的作用。4.3元胡止痛方化学成分组成十分复杂,其治疗偏头痛的功效成分和作用机制研究仍需进一步研究。