类风湿性关节炎(RA)是一种主要累及关节的慢性自身免疫性疾病,由于自身免疫系统紊乱,导致活动关节内炎性细胞浸润和滑膜增生,引起关节软骨和骨的侵蚀和破坏。RA的病因不明,发病机制较为复杂,有许多致病环节和因素相互作用,促炎性细胞因子TNF-α和自身反应性T细胞被认为在RA发病机制中起了很重要的作用。其中,炎性细胞因子TNF-α在RA关节滑膜内高表达,能促使滑膜细胞分泌多种炎性细胞因子,引起炎症反应并能够明显促进滑膜细胞增殖,造成组织损伤,因此,抑制TNF-α的促炎作用对于有效治疗RA至关重要;浸润在RA患者关节腔和滑膜组织中的炎性细胞以CD4+T细胞为主,在RA病程中发挥了关键作用,因此拮抗T细胞是治疗RA的一种有效策略。近年来,TNF拮抗剂逐渐应用于RA临床治疗,其中蛋白治疗药物Etanercept(依那西普,商品名Enbrel)(p75 TNFR-Fc融合蛋白)在临床上获得了很好的疗效,但是依然有一部分患者对此种治疗没有效果或者效果不明显,亟需更有效并改进的替代疗法。基于有多种致病因素参与RA的发生发展,发病机制具有复杂性,单一因素的拮抗很难达到理想的治疗效果,联合阻断不同致病因素已成为很有吸引力的治疗策略。有研究表明,针对T细胞和TNF的联合阻断,可能比TNF的单独阻断能够取得更理想的RA治疗效果。有研究证明,TNF拮抗剂与T细胞拮抗剂联合应用,能够显著增强TNF拮抗剂对RA实验动物模型的治疗效果。因此,应用TNF拮抗剂和T细胞拮抗剂联合治疗RA的策略具有广阔的发展前景。基因治疗是指将外源治疗性基因导入靶细胞,以纠正或补偿由于基因缺陷或异常而引起的疾病,从而达到治疗的目的。即通过基因转移技术将外源治疗性基因转入病人的受体细胞中,使外源治疗性基因发挥有效作用而治疗疾病。基于基因治疗的优势特点,并且RA是一种局部关节受累的自身免疫性疾病,因此本研究拟采用局部基因治疗方法进行RA联合治疗的相关研究。在基因递送载体的选择上,腺相关病毒(AAV)载体具有免疫原性低,转染效率高,能够介导目的基因长期表达等特点,研究发现AAV有十几种血清型,其中AAV2是目前常用的稳定应用于临床治疗的血清型,在国内包装和纯化技术成熟,因此,我们借助于AAV2载体进行RA的基因治疗研究。RA治疗最重要的方式就是诱导免疫耐受,抑制T细胞的激活。本课题组前期成功构建了AAV2介导的CTLA4-Fas L融合分子,其中,CTLA4功能域能够竞争性结合B7,阻断T细胞激活的共刺激信号,诱导耐受;Fas L功能域能够诱导活化T细胞和成纤维样滑膜细胞凋亡,从而通过抑制激活和诱导凋亡发挥对T细胞的双重抑制作用。在本课题前期研究中,我们证明腺相关病毒(AAV)载体介导的CTLA4-Fas L基因能够有效抑制大鼠佐剂诱导性关节炎,并且能够显著减少大鼠关节中自身反应性T细胞浸润,抑制滑膜增生,并进一步证明CTLA4-Fas L融合分子比单独Fas L分子能更有效地控制大鼠关节炎的发展。基于上述研究背景,本课题研究的目的是选取拮抗TNF的融合基因TNFR-Fc和拮抗T细胞的融合基因CTLA4-Fas L,构建腺相关病毒载体AAV2介导的TNFR-Fc和CTLA4-Fas L融合分子,并创新性地在两组融合基因之间引入自剪切多肽furin和2A,能够介导上下游融合基因在同一载体、同一开放阅读框(ORF)中同时、均衡、独立表达,并对两组融合基因协同抑制大鼠佐剂诱导性关节炎(AIA)的炎症反应及相关免疫学作用机制进行深入的探讨。首先,我们将TNFR-Fc融合基因克隆入AAV2载体上,构建成AAV2.TNFR-Fc(命名为TRFC)重组质粒,验证重组质粒在体外细胞模型中获得分泌性表达,并对TNFR-Fc目的蛋白中和rat TNFα的生物学活性进行鉴定。随后,我们将furin裂解位点和2A自剪切序列通过4轮overlap PCR克隆入课题组前期构建的CTLA4-Fas L融合基因,构建成furin-2A-CTLA4-Fas L融合基因,将此融合基因通过相应酶切位点克隆入TRFC重组质粒中,从而构建成我们最终所需的AAV2介导的双融合分子TNFR-Fc(furin-2A)CTLA4-Fas L重组质粒(命名为TFCF);接下来将测序正确的重组质粒瞬时转染HEK-293T细胞,收获的无血清上清经Western Blot和ELISA进行检测,验证重组质粒TFCF在体外细胞模型中获得平行独立共表达。最后,我们将AAV2介导的双融合分子重组质粒进行病毒包装,应用局部基因治疗的方式,将包装后的重组病毒注射到佐剂诱导性关节炎(AIA)大鼠的关节腔内,从免疫后第11天发病起,观察重组病毒协同抑制大鼠关节炎的临床形态学和组织学指标,并通过免疫组化,炎性细胞因子检测,实时定量PCR,脾脏活性检测等进行相关分子机制研究。研究结果表明,(1)成功构建重组腺相关病毒载体质粒p AAV2/TNFR-Fc,验证TNFR-Fc融合基因在体外细胞模型中获得分泌性表达,并证明TNFR-Fc目的蛋白具有中和大鼠TNFα介导的对L929细胞的杀伤活性;(2)将furin裂解位点和2A自剪切序列融合入CTLA4-Fas L基因中,并克隆入TRFC重组质粒中,构建成p AAV2/TNFR-Fc(furin 2A)CTLA4-Fas L重组质粒(命名为TFCF),并验证TFCF重组质粒在体外细胞模型中获得两组融合基因的平行独立共表达;(3)接下来观察双融合分子重组病毒在实验大鼠体内的表达和治疗作用,结果表明,furin和2A自剪切多肽在AAV.TFCF病毒上发挥了有效的切割作用,使上下游基因在关节内实现了平行独立、均衡共表达;(4)通过观察踝关节指数和关节肿胀厚度等临床形态学指标,以及HE染色和番红O固绿等组织学指标结果表明,双融合分子比单融合分子能够更有效降低大鼠关节炎的关节肿胀程度,抑制炎症反应和滑膜增生;(5)我们对双融合分子治疗RA相关分子机制进行了研究和探讨,通过炎性细胞因子检测,证明双融合分子能够明显促进抗炎细胞因子分泌,抑制促炎细胞因子水平,从而控制炎症的持续发展;通过免疫组化检测关节内CD4基因和TNFα基因水平,证明双融合分子组在抑制炎性细胞包括自身反应性CD4+T细胞的浸润方面,要显著优于其他两个单融合分子组,并且能够更有效下调关节内TNFα蛋白水平;流式检测引流淋巴结中CD4+CD25+Fox P3+Treg细胞结果表明,双融合分子TNFR-Fc和CTLA4-Fas L联合抑制大鼠关节炎的作用,部分地取决于上调引流淋巴结中CD4+CD25+Fox P3+Treg细胞水平相关的免疫调节机制;同时通过脾细胞活性检测结果表明,与单融合分子相比,双融合分子能够显著抑制脾细胞的增殖率,改善脾肿大的症状,并且能够抑制与RA病情密切相关的信号分子NO的产生。本研究构建了一种新型表达系统,采用AAV2基因递送载体,创新性地引入furin和2A自剪切多肽,成功构建了新型双融合分子p AAV2/TNFR-Fc(Furin 2A)CTLA4-Fas L,能够同时独立表达两种抗炎蛋白TNFR-Fc和CTLA4-Fas L,从体内细胞与分子机制研究入手,通过各种形态学和组织学等临床观察指标,以及ELISA检测细胞因子水平等相关检测,充分证明这种新型双融合分子的协同抗炎效应,从而提出CTLA4-Fas L联合TNF抑制剂TNFR-Fc协同治疗RA的新思路,为治疗RA提供新策略,为临床新药研发提供有力的理论和实验基础。