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每个miRNA都具有多个靶基因,因此对miRNA下游作用的靶基因进行寻找及功能研究仍是临床及科研的重要方向。而哺乳动物乳腺组织是动物体中少数的随着年龄、发情周期和繁殖状态而发生相应周期性变化器官之一。因此对人乳腺中miR-139-5p靶基因的鉴定及验证至关重要。研究发现miR-139与其靶基因共同作用可影响众多生物学功能,如蛋白定位、细胞周期调控以及抑制肿瘤侵袭等。众所周知,细胞周期的有序进行是生物体生长、发育及繁殖的基础,而细胞周期加快或阻滞会影响细胞增殖及迁移能力,进而至使肿瘤、癌症以及基因突变的发生。为充分研究miR-139-5p的作用和功能,其靶基因的挖掘和鉴定及初步的功能验证成为急需解决的问题。本研究将RNA结合蛋白免疫沉淀(RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RIP)与新一代测序技术相结合,以MCF-10A细胞系为研究对象,鉴定与验证miR-139-5p在乳腺上皮细胞中的靶基因。先运用针对目标蛋白Ago2的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来,然后经过分离纯化,对结合在复合物上的RNA进行测序分析,找出成对样品中的差异峰,进而确认miR-139-5p在MCF-10A中的靶基因,并对靶基因进行KEGG和GO分析;最后运用q PCR等技术对miR-139-5p的靶基因及miR-139-5p部分功能进行验证。这些结果将为miR-139-5p在人乳腺中的功能研究提供新的参考。研究结果如下:(1)RIP-seq测序数据处理及生物信息学分析:RIP-seq测序后我们将由Negative Control组与miR-139-5p mimic组获得的peak进行比较,得到差异基因484个,这些差异基因就是miR-139-5p在MCF-10A细胞中的靶基因,这些靶基因可能是乳腺发育或乳腺进化过程中重要的基因。利用KEGG对靶基因进行通路分析,我们得到204种Pathway,其中显著性通路有21条(P<0.05),涉及到120个靶基因;在GO分析中发现,显著性GO条目448个(P<0.05),主要涉及蛋白定位(protein localization)、细胞周期调控(regulation of cell cycle)、细胞器组成(organelle part)、结合RNA(RNA binding)和结合核酸(nucleic acid binding)等;(2)miR-139-5p靶基因的验证选取的18个靶基因在mRNA水平被miR-139-5p显著下调,表明其表达受miR-139-5p调节。选择细胞周期信号通路对miR-139-5p的靶基因进行功能验证,表明miR-139-5p能显著抑制G1/S细胞周期转变,进而抑制细胞增殖,这种调节是信号通路中多个靶基因共同作用的结果。