研究背景自闭症谱系障碍（Autism spectrum disorder,ASD）是一类广泛性神经发育障碍性疾病的统称,其主要特征是婴幼儿时期即出现的不同程度的语言发育障碍、人际交往功能障碍、重复刻板行为和兴趣范围狭窄等。研究表明ASD多存在神经系统发育及大脑结构异常,如胼胝体及皮质等结构。ASD病因复杂,存在遗传、神经发育和环境因素等多方面的相互作用,其中遗传因素起主要作用,前期通过收集大量临床样本信息发现GIGYF1基因是ASD的高风险致病基因之一,但其导致ASD的具体分子机制尚不清楚,而且其缺失是否会引发神经系统发育异常,目前也不清楚。近年来,基于高效便捷的遗传操作技术及强有力的行为学表型,斑马鱼逐渐成为ASD研究领域较受欢迎的模式动物。斑马鱼在进化过程中经历了基因组的整体复制,人GIGYF1基因的直系同源物在斑马鱼中存在两个同源基因,即gigyf1a和gigyf1b。因此,本研究采用CRISPR/Cas9基因编辑技术在斑马鱼中分别构建了gigyf1a和gigyf1b的单纯合突变体模型,为了防止gigyf1a和gigyf1b基因功能上存在冗余,我们同时构建了gigyf1ab的双纯合突变体模型,并对上述突变体模型进行了初步的形态学观察;通过对幼鱼和成鱼的行为学实验进一步明确了gigyf1基因突变是否会引起斑马鱼的行为异常;同时,我们对发育早期的双突变体幼鱼进行了转录组学及蛋白质组学检测以期发现gigyf1基因在神经发育早期可能参与的分子通路,为下一步具体分子机制的研究提供方向。本研究主要包括以下三个部分:第一部分:gigyf1基因的时空表达谱及突变体模型的构建目的:了解gigyf1a和gigyf1b的时空表达谱,并在斑马鱼中构建gigyf1a和gigyf1b基因的单、双突变体模型,为后续研究神经发育机制打下基础。方法:使用地高辛标记的原位杂交和RT-qPCR实验检测gigyf1a和gigyf1b的时空表达,同时设计有效的g RNA和Cas9 m RNA用于斑马鱼单细胞期注射,经过三代传代筛选获得gigyf1a和gigyf1b的单纯合突变体模型,通过将单突变体模型相互杂交,筛选后获得双突变体模型。结果:gigyf1a和gigyf1b均是母源表达的基因,具有类似的时空表达谱。采用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功获得gigyf1a和gigyf1b基因的单纯合突变体模型及gigyf1ab的双突变体模型,gigyf1a和gigyf1b的单突变体形态学上未见明显异常表型,双突变体表现为体长缩短、眼间距减小。结论:成功获得gigyf1a和gigyf1b的单、双突变体模型,且双突变体在形态学上存在发育异常。第二部分:gigyf1基因纯合突变导致斑马鱼自闭症样行为目的:明确gigyf1基因功能缺失是否会引起斑马鱼的行为学异常。方法:使用同一时期的gigyf1aΔ16/Δ16与gigyf1a+/+、gigyf1bΔ4/Δ4与gigyf1b+/+、gigyf1bΔ23/Δ23与gigyf1b+/+及gigyf1aΔ16/Δ16;gigyf1bΔ4/Δ4与gigyf1a+/+;gigyf1b+/+的幼、成年斑马鱼进行行为学检测,包括明暗刺激实验、新缸实验、浅滩实验、三缸社交实验和镜子实验。结果:gigyf1ab的双突变体幼鱼在明暗刺激实验中表现为运动功能降低;双突变体成鱼在新缸实验中几乎所有的时间均在缸的底部游动,表现出比野生型明显升高的焦虑与恐惧行为;浅滩实验、三缸社交实验及镜子实验均表明双突变体出现明显的社交功能障碍及攻击行为下降。而gigyf1a和gigyf1b的单突变体鱼在以上行为学实验中与野生型相比均未出现明显异常的行为学表型。结论:gigyf1ab的双突变体鱼较野生型出现明显的与自闭症表型相关的行为学异常。第三部分:转录组学和蛋白质组学分析目的:探讨gigyf1基因敲除后斑马鱼大脑转录组及蛋白质组学变化情况。方法:分别获得4.3dpf的gigyf1ab双突变体与野生型幼鱼头部组织各3管,通过提取每管样品的总RNA与蛋白质进行RNA测序（RNA-seq）和蛋白质组学（TMT）检测。结果:转录组测序结果表明差异表达基因富集到各种神经系统过程及眼睛和视觉系统的发育等生物学过程,且差异基因中包含多个ASD风险基因。蛋白质组学测序结果发现gigyf1突变引起的差异蛋白可能参与免疫系统的调节、类固醇激素的反应调节及脂类物质的转运等多种生物学功能。结论:从分子水平理解gigyf1基因的突变可能参与多种生物学功能从而发挥异常的神经生物学作用,为下一步研究gigyf1的分子功能提供实验方向。