研究背景：　　 PARP聚腺苷二磷酸核糖聚合酶，为PolyPolymerase的简写。PARP是真核细胞细胞核中含量最丰富的蛋白质之一，在DNA的修复、基因转录、细胞周期的进程的调控、染色体功能、基因组的稳定性和细胞死亡的调节中发挥重要的作用。PARP-1是PARP家族中含量最多，功能最重要的一种亚型。　　 某些病理情况下出现氧化应激的增加导致DNA单链的断裂，从而引起PARP-1的激活。激活后的PARP-1通过将NAD+中的ADP核糖转移到核蛋白上启动对DNA裂口的修复，但同时也会启动一个能量消耗循环。当PARP-1被过度激活时，这个过程将会引起细胞内NAD+和ATP池的耗竭，减慢糖酵解和线粒体的呼吸速度，导致细胞功能的紊乱，甚至细胞的死亡。过度激活的PARP-1除了通过消耗NAD+引起细胞功能紊乱之外，还可产生大量的核酸样聚合物，这些聚合物除了与有DNA修复作用的蛋白质结合启动DNA的修复程序外，还能与多种功能蛋白质如组蛋白、转录因子、DNA复制因子及信号分子如NF-κB、AP-1、Oct-1、TEF-1、DNA-PK、p53等结合，改变以上蛋白的结构和功能，从不同分子水平影响细胞功能；部分激活的PARP-1也可以通过细胞内酸化导致细胞的功能紊乱和坏死。　　 在糖尿病的慢性病理生理过程中，存在多元醇途径的激活，DAG的形成，继发性PKC的激活和加速的AGE的堆积，以上代谢途径之间相互影响，相互作用，导致了氧化产物和自由基的产生。在糖尿病患者中证实存在氧化应激所导致的碱基修饰、DNA链的断裂等各种形式的DNA损伤。这些损伤的DNA势必会引起PARP-1的过度激活，从而导致PARP-1对细胞的各种损伤。　　 目前研究发现在心肌细胞中PARP-1的过度激活与糖尿病性心肌病、心力衰竭和心肌肥大的发生发展有关；在肾脏中的研究提示PARP的过度激活会导致蛋白尿的增加，肾小球的硬化，系膜细胞分泌ECM增多等；在糖尿病神经病变、糖尿病视网膜病变和白内障的的研究中同样发现存在PARP-1的过度激活，而在应用PARP-1抑制剂后，以上病理生理过程均得到不同程度的改善。　　 糖尿病皮肤功能和结构的异常在糖尿病足的发生、发展及转归过程中扮演重要角色，目前研究提示糖尿病的皮肤病变与糖尿病血管病变、神经病变、细胞功能紊乱及细胞因子分泌异常有关，但具体机制未明。在糖尿病皮肤病变中，PARP-1的研究较少，我们的预实验发现在高糖培养的大鼠真皮成纤维细胞中PARP-1的表达比正糖培养情况下明显增多。鉴于糖尿病皮肤病变在糖尿病足的发生、发展和转归过程中扮演的重要角色，且PARP-1在糖尿病的发生及慢性并发症的发生、发展过程中发挥的重要作用，我们有必要了解PARP-1的激活是否与糖尿病皮肤病变有关。本实验将初步探讨PAPR-1对高糖培养的大鼠真皮成纤维细胞生物学行为的影响，为阐明PARP-1与糖尿病皮肤病变中的关系提供实验依据。　　 研究目的：　　 1.了解高糖对大鼠真皮成纤维细胞生物学行为的影响。　　 2.观察使用PARP-1抑制剂PJ-34后大鼠真皮成纤维细胞生物学行为的改变，为探讨PARP-1在糖尿病皮肤病变的发病机制中所起的作用提供实验依据。　　 材料与方法　　 1.细胞培养：　　 大鼠真皮成纤维细胞细胞株RCL1214在含1g/L的D-glucose的DMEM培养基中培养，同时添加10％胎牛血清，待细胞长至80％-90％融合后，予消化传代及种板干预。　　 2.实验内容：　　 (一)高糖对大鼠真皮成纤维细胞活力、迁移能力及凋亡的影响实验分组：正糖组高糖组细胞活力的检测：大鼠真皮成纤维细胞CRL1214以2-3×103/孔的密度接种至96孔板，待细胞贴壁后，予更换0.5％胎牛血清的正糖培养基进行饥饿24h，使细胞进入同步化状态。饥饿24h后分别更换为含10％胎牛血清的正糖和高糖DMEM培养基培养，每组设5个复孔，继续培养，并在培养的72h按照CCK-8试剂盒操作说明进行CCK-8检测，最后于我实验室酶标仪进行OD值的检测，检测波长为450nm和630nm。每组设5个复孔，每次取5个复孔OD值的平均值，实验重复5次。细胞迁移能力的检测：大鼠真皮成纤维细胞以1.5-2×105/孔的密度接种至6孔板，6孔板事先用marker笔在孔底的背面划平行线，间隔0.5-1cm画一条，每孔划5条。待细胞60％-70％融合后，予更换0.5％胎牛血清的正糖DMEM培养基进行饥饿24h，使细胞进入同步化状态。饥饿24h后按实验分组更换含10％胎牛血清的正糖和高糖DMEM培养基，继续培养24h后，于无菌操净台下用灭菌小枪头沿着直尺在6孔板板底划痕，划痕尽量与之前的划线相垂直，划痕完毕后用PBS沿着划痕反复冲洗，将划痕区域的细胞彻底洗净，后加入以上干预培养基，继续培养，并分别于划痕后0h，6h拍照，并测量划痕区的宽度。实验重复3次。　　 细胞迁移速率=(初始划痕宽度值—相应点划痕宽度值)/初始划痕宽度值×100％细胞凋亡的检测：大鼠真皮成纤维细胞以1.5-2×105/孔的密度接种至6孔板，待细胞长至70％融合后，予更换0.5％胎牛血清的正糖培养基进行饥饿24h，使细胞进入同步化状态。饥饿24h后按实验分组更换目的培养基，继续培养48h后，用不含EDTA的胰酶消化细胞并用PBS洗涤两次后送流式细胞仪进行AnnexionV/PI染色检测细胞凋亡。每次设三个复孔，每次取平均值，实验重复3次。　　 (二)比较PARP-1m RNA在正糖和高糖及高糖+PJ-34情况下表达的差异实验分组：正糖组(1g/L D-glucose　　 高糖组　　 高糖+PJ-34组　　 实验方法：大鼠真皮成纤维细胞以1.5-2×105/孔的密度接种至6孔板，70％融合后，予更换0.5％胎牛血清的正糖培养基进行饥饿24h，使细胞进入同步化状态。饥饿24h后按实验分组更换10％胎牛血清的正糖和高糖DMEM培养基及高糖+1μmol/L PJ-34(购自默克公司)的DMEM培养基，继续培养24h后按Trizol(购自Invitrogen公司)试剂操作说明提取细胞RNA，进行完整性、纯度和浓度检测后取400ng提取的RNA按照TAKARA-RT试剂盒说明进行RT，将RT后得到的cDNA取80ng以β-acting为内参基因按照TAKARA-Real Time PCR试剂盒(购自大连宝生生物有限公司)进行Real Time PCR检测，每组设3个复孔，取平均值，实验重复3次。　　 (三)PARP-1对高糖情况下大鼠真皮成纤维细胞活力、迁移能力及凋亡的影响　　 实验分组：高糖组(4.5g/L D-glucose)　　 高糖+PJ-34组(4.5g/L D-glucose+1μmol/L PJ-34)细胞活力、迁移能力的检测及凋亡的检测同第一部分实验。　　 3.统计学方法：　　 数据以mean±SD表示，数据分析采用SPSS16.0进行，数据进行正态性检验后，两组之间的比较采用两独立样本的t检验，α=0.05。　　 实验结果　　 1.高糖对大鼠真皮成纤维细胞活力、迁移能力和凋亡的影响　　 1.1高糖对大鼠真皮成纤维细胞活力的影响　　 高糖培养72h的大鼠真皮成纤维细胞活力(1.595±0.079)较正糖培养细胞活力(1.758±0.101)明显减低，差异有统计学意义(P＜0.05)。　　 1.2高糖对大鼠真皮成纤维细胞迁移能力的影响　　 高糖干预24h后，大鼠真皮成纤维细胞6h迁移率为0.273±0.041，较正糖组迁移率0.348±0.024明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。　　 1.3高糖对大鼠真皮成纤维细胞凋亡的影响　　 与正糖培养48h的大鼠真皮成纤维细胞相比，高糖干预48h后，细胞凋亡增加，但差异无统计学意义。　　 2.PARP-1mRNA在正糖、高糖及高糖+PJ-34培养的大鼠真皮成纤维细胞中表达的差异　　 高糖干预24h后，大鼠真皮成纤维细胞表达PARP-1mRNA较正糖组增多，但差异无统计学意义。高糖加PARP-1抑制剂干预24h后，PARP-1mRNA的表达量较高糖干预24h明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。　　 3.PARP-1对高糖培养下的大鼠真皮成纤维细胞活力、迁移能力及凋亡的影响　　 3.1 PARP-1对高糖培养的大鼠真皮成纤维细胞活力的影响　　 与高糖组培养的大鼠真皮成纤维细胞活力(1.595±0.079)相比，使用PARP-1抑制剂后，细胞活力(1.924±0.026)明显改善，差异有统计学意义(P＜0.05)。　　 3.2 PARP-1对高糖培养的大鼠真皮成纤维细胞迁移能力的影响　　 高糖+PJ-34组干预24h的大鼠真皮成纤维细胞细胞6h迁移率(0.342±0.043)较高糖组(0.273±0.041)明显提高，差异有统计学意义(P＜0.05)。　　 3.3 PARP-1对高糖培养的大鼠真皮成纤维细胞凋亡的影响　　 高糖+PJ-34组干预48h的大鼠真皮成纤维细胞凋亡率(4.38±0.96)较高糖组(7.31±2.08)明显减少，差异有统计学意义(P＜0.05)。　　 结论：　　 1.高糖培养的大鼠真皮成纤维细胞活力下降，迁移能力减低，凋亡增加。　　 2.PARP-1可能参与高糖导致的大鼠真皮细胞生物学行为的改变过程。