第一部分脑出血后患者及大鼠外周血炎症细胞的变化规律及病理特征背景与目的脑出血(Intracerebral hemorrhage,ICH)是一类常见的威胁老年人健康的脑血管疾病,病死率高、致残率高,是除心血管疾病外,致国人死亡和残疾的主要原因之一,并有逐年超过心血管死亡率的趋势。外科手术治疗除脑叶出血证实略优于药物治疗外,深部ICH外科手术未显示出提高患者预后效果,且迄今仍无有效的干预策略和治疗手段。日益增加的实验研究显示炎症在ICH继发性脑损伤扮演重要角色。多项临床研究显示ICH患者外周血多形核中性粒细胞(Polymorphonuclear-neutrophils,PMNs)计数升高,NLR(PMNs to Lymphocyte ratio)比值升高现象是ICH患者预后不良的重要因素,且PMNs计数升高导致血肿周围水肿加重,提示PMNs在ICH继发性脑损伤中可能扮演重要角色。故而本研究回顾分析了ICH入院患者流行病学信息以及外周血中Leu、PMNs及Lym的变化特征,并建立ICH-SD大鼠ICH模型对ICH后外周血PMNs及病灶区浸润的变化特点进行初步探索研究。材料与方法研究分临床回顾分析及动物实验两部分:一、临床病例回顾分析:通过计算机病例检索系统查询2016年1月1日至2019年1月30日时间段内出院诊断包含关键字“脑出血”与“脑膜瘤”患者,采集患者性别、年龄、基础疾病,入院血压、入院后首次血常规数据等,对患者基本信息整理分析,了解ICH后外周血PMNs等细胞变化特征;并根据外周血中PMNs计数是否大于6.3*10~9/L(迈瑞BC-5800机器设定参考值)分为PMNs计数升高组(ICH-PMNs-H)与PMNs计数正常组(ICH-PMNs-N)两个亚组,进一步分析患者炎症细胞变化规律。二、使用自体动脉非抗凝全血,立体定位注射右侧基底节的方法建立SD(Sprague-Dawley)大鼠ICH模型,对ICH后病灶区PMNs浸润及外周血炎症细胞-PMNs分析,明确SD大鼠ICH后外周血PMNs情况是否同ICH患者存在类似的现象。结果1、ICH患者纳入分析共计96例,外周血中Leu、PMNs计数为(10.02±3.63)*10~9/L与(8.31±3.53)*10~9/L,Control组纳入75例,外周血中Leu、PMNs计数分别为(5.83±1.62)*10~9/L与(3.73±1.44)*10~9/L,提示ICH组中Leu及PMNs计数明显升高,与Control组分别比较具有统计学差异(p<0.01);ICH组外周血中Lym计数为(1.26±0.81)*10~9/L,Control组外周血中淋巴细胞计数为(1.63±0.50)*10~9/L,提示ICH组中淋巴细胞数量降低,两组比较具有统计学差异(p<0.01);ICH组NLR比值为7.97±4.90,Control组NLR比值为2.61±1.68,ICH组NLR较Control组升高约3倍,两组比较有显著统计学差异(p<0.01)。2、ICH亚组分析,ICH-PMNs-H组在ICH组中占比为64.58%(62/96);ICH-PMNs-N组在ICH组患者中比例为35.41%(34/96)。PMNs在Leu中占比在ICH组、ICH-PMNs-H组、ICH-PMNs-N组及Control组分别为(81.62±0.08)%、(84.54±0.06)%、(76.30±0.08)%;(62.61±0.10)%;ICH组及ICH亚组与Control比较均具有统计学差异(p<0.01);此外ICH-PMNs-N组在PMNs、Lym计数、NLR比值与Control组比较亦均有统计学差异(p<0.01)。3、SD大鼠ICH模型血常规结果显示,ICH后大外周血中Leu计数、PMNs计数升高,较Sham组比较具有显著统计学差异(p<0.01);且NLR亦较Sham组明显升高,与Sham组比较有显著统计学差异(p<0.01)。此外、ICH模型后脑组织冰冻切片显示颅内血肿周围存在大量的PMNs炎症细胞脑实质浸润。结论1、患者脑出血后,存在外周血PMNs计数及NLR升高、Lym计数降低的现象。2、SD大鼠ICH模型亦存在外周血PMNs计数及NLR升高现象,血肿周围存在大量PMNs浸润现象,提示SD大鼠自体血ICH模型可以用来研究炎症细胞-PMNs在ICH中的作用及进行相关干预效果研究。第二部分辛伐他汀调控多形核中性粒细胞Mcl-1减轻脑出血损伤的作用及机制研究背景与目的辛伐他汀是一种广泛应用于调节血脂及心血管疾病的药物,已被证实具有良好的临床疗效。一项研究显示辛伐他汀可上调心脏搭桥术后患者外周血PMNs凋亡率,降低血浆炎症因子水肿。且日益积累的证据显示他汀类药物在ICH后具有神经保护作用,能改善ICH患者预后。髓细胞白血病基因1(Myeloid cell leukemia-1,Mcl-1)是调控PMNs生存的关键基因。故而我们推测辛伐他汀可能通过下调Mcl-1基因相关蛋白表达促进外周血PMNs凋亡,降低PMNs计数及NLR比值,减少PMNs在病灶区域过度聚集,对ICH患者预后可能发挥神经保护作用。因此我们在第一部分实验研究基础上,重点阐释辛伐他汀在ICH发生、发展中对PMNs的作用,并进一步阐释他汀通过下调Mcl-1表达促进PMNs凋亡发挥神经保护作用。材料与方法实验分为三部分。第一部分:检测辛伐他汀是否降低外周血中PMNs计数及减轻ICH后脑病灶区PMNs脑浸润(MPO染色),检测血肿周围组织趋化因子、细胞间黏附分子及炎症因子表达情况,动物分为三组,对照组(Sham)仅给予针插入,出血组(ICH+Veh)100ul自体股动脉血基底节注射,治疗组(ICH+Simva)大鼠自术前5d至术后处死前每天给予辛伐他汀药物腹腔注射(2mg/kg)。在1d、3d及7d行血常·规计数PMNs数量及行免疫荧光染色(n=6只/组)。术后6h、12h及24h冰上取血肿周围脑组织行RT-PCR检测趋化因子(CCL2、CXCL10),细胞间黏附分子-1(ICAM-1)及炎症因子(TNF-α、IL-6)m RNA表达情况(n=4只/组)。第二部分:在1d、3d及7d行神经行为学评分及在24h、72h时行脑组织含水量测定评估辛伐他汀是否具有神经保护作用(n=6只/组)。第三部分:机制探索,在1d、3d及7d采用密度梯度离心方法获取纯PMNs和Lym,行流式细胞分析检测细胞凋亡情况(n=6只/组);在24h及3d提取PMNs并冰上裂解提取蛋白行免疫印迹检测凋亡相关蛋白表达情况(n=4只/组)。结果1、血常规检验结果ICH后血常规显示Leu计数在24h、3d、7d均升高,且呈上升趋势,7d为高峰;PMNs计数24h为峰值,3d较低,7d时再次升高;Lym计数显示24h降低,3d及7d均升高;NLR比值在24h时明显升高。辛伐他汀治疗,Leu计数与ICH组比较24h及3d无明显差异,在7d时明显降低,具有统计学差异(p<0.05);PMNs计数与ICH组比较,在24h及7d时明显降低,具有统计学差异(p<0.05);在早期(24h)辛伐他汀可以显著升高血常规中Lym数量,在晚期(7d)降低外周血中Lym数量;辛伐他汀在出血后24h时可以逆转ICH导致的NLR比值升高。2、脑组织切片MPO免疫荧光染色ICH+Veh组脑组织切片MPO免疫荧光在24h、3d及7d时均可见大量MPO染色阳性细胞表达,24h为表达高峰,随后下降,与Sham比较有显著统计学差异(p<0.01)。ICH+Sivma组脑组织切片MPO免疫荧光显示在24h、3d及7d时均有MPO染色阳性细胞表达,但与ICH+Veh组脑组织切片MPO免疫荧光阳性细胞数量比较均明显减少,具有统计学差异(p<0.05)。3、血肿周围脑组织炎症因子、趋化因子及细胞间黏附分子表达Sham组血肿周围脑组织中炎症因子IL-6与TNF-α,趋化因子CCL2与CXCL10及细胞间黏附分子ICAM-1的m RNA表达处于极低水平;脑出血后炎症因子TNF-αm RNA表达规律为6h为高峰,随后逐渐降低;IL-6 m RNA表达规律为6h升高,12h达到高峰,24h降低;趋化因子CCL2 m RNA为6h升高,12h达到高峰,且24h维持较高水平;CXCL10 m RNA为6h高峰,随后逐渐下降。细胞间黏附分子ICAM-1m RNA表达规律是6h升高,12h达到高峰,此后迅速下降。当给予辛伐他汀预治疗,血肿周围炎症因子TNF-α、IL-6 m RNA显著降低,与ICH组比较具有统计学差异(p<0.05);血肿周围趋化因子CCL2 m RNA在12h及24h显著降低,与ICH组比较具有统计学差异(p<0.05);趋化因子CXCL10 m RNA在6h及12h降低不明显,24h降低明显,24h时与ICH组比较具有统计学差异(p<0.05);细胞间黏附分子ICAM-1m RNA在6h及12h显著降低,与ICH组比较具有统计学差异(p<0.05),24h时三组之间未见明显差异。4、脑水肿评价ICH组血肿同侧基底节及皮层脑组织含水量在24h及72h时较Sham组脑含水量明显升高,与Sham组比较具有统计学差异(p<0.05),且ICH+Veh组脑含水量在3d时较术后24h升高,提示3d水肿更重;ICH+Sivma组血肿同侧基底节及皮层脑含水量在24h及72h时较ICH+Veh组脑含水量明显降低,两组比较具有统计学差异(p<0.05),对侧基底节区、皮层及小脑对照均未见明显统计学差异。5、神经行为学评价脑出血后ICH+Veh组m NSS评分显著升高、前肢放置伸出左侧前肢次数明显减少,转角实验时向左转向能力明显减弱,与Sham组比较具有明显统计学差异(p<0.05),提示脑出血造成的神经功能损害明显。ICH+Simva组m NSS评分、前肢放置及转角实验显示早期1d及3d有所好转,但与ICH+Veh组未见明显差异,7d时ICH+Simva组m NSS评分显著降低、左侧肢体伸出次数增加及向左能力亦明显好转,与ICH+Veh组比较具有明显统计学差异(p<0.05)。6、PMNs及Lym凋亡检测A、PMNs细胞凋亡。Sham组外周血PMNs细胞凋亡率24h、3d及7d为(13.04±1.65)%、(13.74±1.90)%、(12.73±1.47)%,脑出血后(ICH+Veh组),外周血PMNs细胞凋亡率24h时升高(15.34±1.50)%,3d及7d时维持较低水平((5.36±1.56)%,(4.88±2.09)%),与Sham比较均有统计学差异(p<0.05)。ICH+Simva组PMNs细胞凋亡率24h时升高更为明显(17.68±1.86)%,与ICH+Veh组比较具有统计学差异(p<0.05);3d时ICH+Simva组细胞凋亡率下降(8.02±2.27)%,但仍明显高于ICH+Veh组凋亡率;7d时ICH+Simva组PMNs凋亡率与ICH+Veh组比较无明显统计学差异(p>0.05)。B、Lym细胞凋亡。Sham组外周血中Lym细胞凋亡率在24h、3d及7d为(13.93±1.23)%、(13.23±2.11)%、(12.49±1.76)%;ICH+Veh组外周血Lym细胞凋亡率24h时短暂下降(11.79±1.55)%,3d凋亡率达到(27.70±3.63)%,7d时下降(17.07±3.13)%,与Sham比较均有统计学差异(p<0.05)。ICH+Simva组Lym细胞凋亡率24h(16.49±1.30)%、3d(29.06±3.22)%及7d时(22.96±2.63)%均明显升高,24h及7d时与ICH+Veh组比较有统计学差异(p<0.05)。7、WB电泳ICH后,24h时,PMNs抗凋亡蛋白Mcl-1、Bcl-2表达降低,促凋亡蛋白Bax、Cleaved caspase-3表达升高,与Sham组分别比较有统计学差异(p<0.05)。辛伐他汀治疗后,抗凋亡蛋白Mcl-1、Bcl-2表达较ICH组显著降低,促凋亡蛋白Bax、Cleaved caspase-3较ICH组显著升高,与ICH组分别比较有显著统计学差异(p<0.05)。结论1、ICH后外周血中PMNs计数及NLR升高;血肿周围PMNs浸润,趋化因子、细胞间黏附分子及炎症因子m RNA表达水平升高;共同致使ICH后BBB损伤、脑水肿加重与神经功能障碍;2、辛伐他汀降低外周血PMNs计数,升高Lym数量及降低NLR比值;减少血肿周围PMNs浸润,同时降低趋化因子、细胞间黏附分子及炎症因子m RNA表达,减轻脑水肿、保护BBB及改善神经功能障碍;3、初步阐释辛伐他汀对ICH的保护机制:下调PMNs抗凋亡基因相关蛋白Mcl-1及BCL-2表达,上调促凋亡蛋白Bax及Cleaved caspase-3表达;上调外周血中PMNs凋亡率并降低PMNs计数,从而减轻病灶区浸润导致的炎症损伤。第三部分辛伐他汀通过FPR2-MAPK-MCL-1信号通路介导PMNs凋亡减轻脑出血脑损伤作用机制研究背景与目的我们前期实验研究结果显示HMG-Co A还原酶抑制剂-辛伐他汀能有效降低外周血循环中PMNs细胞计数和NLR比值,显著抑制PMNs在ICH病灶区浸润,减轻了脑出血导致脑组织水肿和神经功能缺损。进一步研究发现辛伐他汀介导的ICH后神经保护作用可能是部分通过加速外周循环中PMNs的凋亡、降低脑出血病灶区趋化因子、细胞间黏附分子-1表达及减少炎症因子释放实现的。初步探明HMG-Co A还原酶抑制剂通过作用于PMNs对ICH有潜在的治疗作用,有可能成为新的治疗靶点。甲酰肽受体-2(N-formyl peptide receptor 2,FPR2)广泛表达在PMNs细胞膜上,ICH时病灶区域细胞凋亡坏死时释放出线粒体,其基因编码的线粒体甲酰肽(Formyl peptide,FP)、心磷脂、ATP等可以作为损伤相关模式分子(Damage-associated molecular patterns,DAMPs)可激活胞膜上FPR2受体对炎症细胞包括PMNs起招募作用,促进炎症细胞局部浸润及引起继发性脑损伤。文献研究显示FP同PMNs膜上FPR2受体具有高亲和力,结合后可引起胞内钙稳态失衡、MAPK(P38、ERK)的磷酸化,诱导IL-6和TNF-α等炎症因子分泌,产生基质炎症反应刺激信号。因此,我们结合文献报道推测辛伐他汀可能通过LXA4-FPR2-MAPK-MCL-1途径发挥促PMNs凋亡作用。因此,本部分实验研究中将在前一部分研究基础之上,重点对HMG-Co A还原酶抑制剂调控PMNs凋亡基因Mcl-1上游途径做进一步的探索研究。材料与方法本研究三部分:第一部分,验证辛伐他汀预治疗是否上调外周血液循环中LXA4含量;第二部分,检测辛伐他汀对FPR2、MAPK(P38/pp38、PERK/P-PERK)、Mcl-1的相关作用,并使用抑剂Boc-2阻断FPR途径,验证PMNs相关蛋白表达;第三部分,检测病灶区炎症因子、补体C3、髓鞘碱性蛋白(Myelin basic protein,MBP)表达情况,观察脑组织PMNs浸润及脑水肿、并进一步行行为学评价神经功能。结果1、辛伐他汀可以增加大鼠ICH后外周血血浆中LXA4含量;2、ICH后外周血Leu、PMNs计数均升高,辛伐他汀及LXA4治疗均可以降低升高的外周血Leu、PMNs计数;Boc-2可以阻断辛伐他汀的这种治疗作用;3、辛伐他汀及LXA4干预治疗可以上调ICH后PMNs跨膜蛋白FPR2表达,降低MAPK相关蛋白磷酸化水平(P38、PERK),下调抗凋亡蛋白Mcl-1表达,上调促凋亡蛋白Bax表达;阻断剂Boc-2可以阻断辛伐他汀对PMNs相关作用;4、辛伐他汀及LXA4干预治疗可以降低ICH后血肿周围炎症因子IL-6、TNF-α及补体C3表达;上调MBP表达;阻断剂Boc-2可以阻断辛伐他汀减轻炎症因子及补体因子的作用。5、辛伐他汀及LXA4干预治疗可以减轻ICH后脑组织水肿,促进神经功能恢复;阻断剂Boc-2使用后的脑组织水肿及神经行为学恢复减慢。结论1、辛伐他汀可上调ICH后外周血血浆中LXA4含量,并继而通过FPR2-MAPK-Mcl-1途径促进PMNs凋亡;阻断剂Boc-2可以阻断辛伐他汀对PMNs的促凋亡作用。2、辛伐他汀降低外周血中Leu、PMNs计数;减少血肿周围脑组织PMNs浸润,降低炎症因子IL-6、TNF-α及补体C3水平;升高MBP含量,减轻脑水肿、促进神经功能恢复;阻断剂Boc-2能阻断辛伐他汀的这些作用。