结核病（tuberculosis，TB）是一种古老的严重影响人类健康的世界性传染病。虽然在很大程度上是可以治愈的，但是近年来结核病有卷土重来的趋势，根据WHO报道，尽管有各种各样的应对策略，但是仅2010年就新增结核病患者为900万，并且有140万人死于结核病。如今结核病再一次成为威胁人类健康的杀手，对于结核分枝杆菌免疫机制的研究也成为各国科学家研究的热点。　　结核病是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，M.tb）引起的，其中肺结核约占70％，其他有淋巴结结核、骨结核和脑膜结核等。在肺结核的感染过程中，肺泡巨噬细胞是控制结核分枝杆菌的主要效应细胞之一。但是肺泡巨噬细胞是把“双刃剑”，它既能够杀伤一部分入侵的结核分枝杆菌，又能够成为入侵的结核分枝杆菌的避难所。所以肺泡巨噬细胞与结核分枝杆菌的相互作用直接决定着结核病的发生、发展以及预后。因此巨噬细胞在结核病的研究中十分重要。　　本研究主要从结核分枝杆菌对SLAM表达的调节，SLAM对结核分枝杆菌识别及SLAM识别结核分枝杆菌对巨噬细胞功能的影响以及SLAM在小鼠感染模型中的作用三个方面研究SLAM在结核分枝杆菌感染中的作用。首先我们成功建立了结核分枝杆菌感染巨噬细胞和小鼠的模型，证明结核分枝杆菌在感染巨噬细胞后可以上调SLAM的表达。然后，我们成功构建了SLAM上调表达及下调表达的真核表达质粒，并通过包装慢病毒建立了稳定上调和下调表达SLAM的RAW264.7巨噬细胞系，进而证明SLAM的上调表达可以促进相关炎症反应，并且SLAM的上调或下调表达可以影响巨噬细胞对结核分枝杆菌的杀伤。但是SLAM不可以直接结合BCG，也不会在BCG感染后参与自噬小体的形成。我们通过聚乙烯亚胺包裹质粒的方法在体内对SLAM的表达进行上调和下调干预，结果证明SLAM的表达可以促进肺脏炎症反应，增强肺部病理变化的程度，促进肺部结核分枝杆菌的清除。从而为进一步研究结核分枝杆菌在机体内的免疫机制提供一定的理论依据，进而为新型疫苗的研发和免疫治疗方法的创新提供了新的方向。　　一、结核分枝杆菌对SLAM表达的调节　　1.结核分枝杆菌感染模型的建立　　为了研究SLAM在结核分枝杆菌感染过程中的作用，根据文献我们建立了结核分枝杆菌感染的小鼠模型和细胞模型。每只C57BL/6J小鼠经鼻腔滴入1×107CFU的BCG，4周后取样检测。病理切片和菌落形成单位（CFU）实验结果证明，正常小鼠肺脏经过HE染色后可以看到肺泡壁很薄，没有炎症细胞浸润及出血等症状，而结核分枝杆菌感染后的小鼠肺脏可以明显看到肺泡壁变厚，肺间质有大量炎症细胞浸润，肺泡腔有出血症状。另外感染后的小鼠肺脏中能检出约105-106数量级的结核分枝杆菌，未感染小鼠的肺脏中则没有该菌检出。综上结果说明小鼠感染模型建立成功。同时我们以（MOI10:1）的量用BCG感染RAW264.7细胞，6小时后检测该细胞中炎症相关细胞因子的mRNA水平，结果显示BCG感染后各炎症因子都有明显上调，与文献报道相符，证明细胞感染模型的建立成功。　　2.结核分枝杆菌的感染可以上调SLAM的表达　　在结核分枝杆菌感染模型建立后，我们用流式细胞术检测了小鼠肺脏巨噬细胞上SLAM的表达情况，实验结果证明在感染BCG后，小鼠肺脏巨噬细胞上SLAM会上调表达，SLAM阳性的巨噬细胞比例由感染前的12%左右上升到感染后的19%左右。RAW264.7细胞在感染BCG后，SLAM的表达也会上调。Real-time PCR结果显示感染BCG后6h SLAM的mRNA水平上调80倍左右，流式结果显示在BCG感染24h后SLAM蛋白表达水平上调3倍左右。　　二、SLAM对结核分枝杆菌的识别及对巨噬细胞功能的影响　　1. SLAM基因的克隆及各真核表达载体的构建　　为了研究SLAM在结核分枝杆菌感染过程中的作用，我们设计相关引物，构建了SLAM的上调表达载体。首先我们设计了特异性引物从小鼠脾脏总RNA中成功扩增出SLAM基因，测序正确后将其插入到pcDNA3.1（-）和pDsRED-N1两个真核表达载体中。细胞转染后经western blot和免疫荧光检测，pcDNA3.1-SLAM和pDsRED-N1-SLAM都能够正常表达。　　2.SLAM基因上调及下调表达慢病毒载体的构建、病毒包装及相应细胞株的建立　　为了研究SLAM在结核分枝杆菌感染过程中的作用，我们设计了相关引物及shRNA，构建了SLAM的上调和下调表达慢病毒载体载体，并用包装的病毒建立了稳定表达细胞系。首先我们根据shRNA原则设计了针对载体pLL3.7的shRNA，和针对载体pMSCV的引物。经测序鉴定pLL3.7-shRNA-SLAM和pMSCV-SLAM构建成功。然后将构建好的病毒包装载体与各自对应的辅助载体以一定比例共转染293T细胞，48h后收集含病毒的细胞上清，感染RAW264.7细胞。感染后36h观察绿色荧光蛋白的表达。然后流式细胞仪分选得到高纯度的SLAM表达上调或下调的RAW264.7细胞。　　3.SLAM能增强BCG感染后巨噬细胞的炎症反应　　在BCG感染SLAM上调或下调RAW264.7细胞后，我们用Real-time PCR的方法检测了细胞中TNF-α、IL-1β和IL-6各炎症因子的mRNA表达水平。结果显示，在SLAM上调表达后，巨噬细胞中TNF-α、IL-1β和IL-6的基础表达都有所下降，其中IL-1β和IL-6下降约两倍（P<0.05），TNF-α有下降趋势。奇怪的是在BCG感染后，却出现相反的现象，SLAM上调表达组的TNF-α和IL-1β表达显著高于对照组（P<0.05）。然而IL-6的表达却不同，与对照相比，在BCG感染后其表达没有像TNF-α和IL-1β那样上升，反而呈下降趋势（P<0.05）。在下调SLAM的表达后，巨噬细胞内促炎因子的基础表达水平有上升趋势。在SLAM下调表达后，巨噬细胞中TNF-α、IL-1β和IL-6的基础表达都有所上升，其中IL-1β和IL-6上升很明显（P<0.05），TNF-α仅表现出上升趋势。有趣的是BCG感染后，与对照组相比SLAM下调组的TNF-α和IL-1β表达则显著下降（P<0.05）。IL-6的表达依然与众不同，与对照相比，在BCG感染后其表达没有像TNF-α和IL-1β那样下降，反而呈上升趋势（P<0.05）。　　三、SLAM在小鼠感染模型中的作用　　1.SLAM促进结核分枝杆菌感染后的炎症反应　　为了研究小鼠感染结核分枝杆菌后SLAM在体内的功能，我们以PEI包裹质粒体内转染的方法在小鼠体内上调和下调表达SLAM，滴鼻感染BCG，4周后取小鼠肺脏做病理切片，HE染色后镜下观察。结果发现，在BCG感染后各组小鼠的肺脏都有病变及炎症浸润。但是对比发现，SLAM上调组小鼠的肺脏炎性浸润最严重，呈现实质性病变，形成大量结节，其对照组的炎性浸润相对较轻，形成的实质性结节也相对较小；SLAM下调组小鼠的肺脏炎性浸润最少，只有很小的实质性结节形成，而其对照组病变则较为严重。通过肺损伤评分能很直观的看出，SLAM上调可以促进小鼠肺部炎症的发生，SLAM下调可以抑制小鼠肺部炎症的发生（P<0.05）。　　2.SLAM促进小鼠对结核分枝杆菌的清除　　结核分枝杆菌能逃逸机体免疫系统的杀伤和清除，这是其难以防治的一个主要因素。为了研究SLAM在结核分枝杆菌感染小鼠模型中是否对该病菌的生存与繁殖产生影响，我们做了小鼠肺脏的病理切片，并且用抗酸染色法检测肺脏中BCG的存在。结果显示与对照组相比，SLAM上调表达小鼠的肺脏中呈红色的BCG数目最少，这或许与其炎症程度有关，较强的炎症反应促进了机体对BCG的杀伤与清除；SLAM下调组小鼠肺脏中的BCG最多，与对照组小鼠相比，SLAM下调组小鼠的肺脏很多细胞中都有红色BCG的存在。另外CFU实验结果显示SLAM下调组结核分枝杆菌的CFU高于其他组，SLAM上调组结核分枝杆菌的CFU低于其对照组（P<0.05）。　　3.SLAM对小鼠肺脏巨噬细胞炎症因子的影响　　在体外SLAM能在巨噬细胞上调节炎症相关细胞因子的表达，并且在体内SLAM也能影响结核分枝杆菌感染后小鼠肺脏的病理变化，那么SLAM能否在体内影响小鼠肺脏巨噬细胞炎症因子的表达还不清楚。为此我们在上调和下调表达SLAM的小鼠感染结核分枝杆菌4周后，取其肺脏制成单细胞悬液，用流式细胞仪分析CD11b+F4/80+阳性的巨噬细胞中TNF-α和IL-10的表达情况。结果显示，SLAM上调组小鼠TNF-α阳性的肺脏巨噬细胞多于其对照组（P<0.05）；SLAM下调组小鼠TNF-α阳性的肺脏巨噬细胞少于其对照组（P<0.05）。流式分析发现，SLAM下调组小鼠IL-10阳性的肺脏巨噬细胞多于其对照组（P<0.05）；SLAM上调组小鼠IL-10阳性的肺脏巨噬细胞少于其对照组，但并不显著（P≥0.05）。