心功能不全是冠状动脉性心脏病、心肌梗死、心绞痛和心率失常等各种心血管疾病的终末阶段,尽早进行预防以及治疗对心血管疾病的预后有着十分重大的意义。大量研究发现,心功能不全早期广泛存在的心肌细胞凋亡,在心功能不全发生发展的进程中起着举足轻重的作用。但是,心功能不全过程中导致心肌细胞凋亡的机制并不十分清楚。近年来的临床研究显示,40%-60%的心功能不全患者血清中可以检测到β1 肾上腺素受体自身抗体(β1-adrenergic receptor autoantibody,β1-AA),后者可以通过与β1-肾上腺素受体(β1-adrenergic receptor,β1-AR)细胞外第二环(β1-AR-ECⅡ)结合诱导心肌细胞凋亡。然而,β1-AA如何引发心肌细胞凋亡目前还不很清楚。我们前期研究发现,β1-AA可以引起心肌细胞自噬水平发生下降。他人的研究发现,自噬和细胞凋亡可以在一个细胞中共存,参与细胞自稳的调控;在某些情况下,自噬作为应激反应,可以通过抑制细胞发生凋亡从而保护细胞免于死亡。因此,细胞自噬可能在细胞凋亡中发挥非常重要的调控作用。然而,βi-AA导致自噬水平的降低与β1-AA诱导的心肌细胞凋亡之间是否相关并不清楚。因此,本研究使用β1-AR-ECⅡ抗原肽段,主动免疫雄性Wistar大鼠,第8周时用亲和层析法提纯动物血清中的βi-AA,作用于H9c2心肌细胞以及原代乳鼠心肌细胞进行实验研究。通过Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术、Hoechst 33258染色以及Caspase-3的活性检测这三种方法来反映心肌细胞凋亡情况;采用CCK-8法检测心肌细胞死亡程度,结果发现βi-AA诱导的心肌细胞凋亡参与了心肌细胞的死亡。此外,本研究还运用Western blot及Real-time PCR方法检测白噬相关蛋白LC3,Beclin 1和P62的表达,结果显示β1-AA在早期可以诱导自噬水平短暂升高,随后出现明显降低。为了进一步观察心肌细胞自噬水平的降低在β1-AA诱发的心肌细胞凋亡中发挥的作用,本实验采用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)对自噬进行抑制,以及使用mTOR通路抑制剂雷帕霉素(Rapamycin,Rapa)上调自噬后进一步观察心肌细胞凋亡水平的改变,结果发现自噬的下降促进了β1-AA诱导的心肌细胞凋亡,并进一步探讨了可能的线粒体机制。本研究旨在从白噬的角度探讨β1-AA诱导凋亡的可能机制,为改善心功能不全患者的预后及疾病进展提供一定的实验依据。目的:本研究通过使用β1-AA建立细胞模型,探讨细胞自噬发生的改变在β1-AA诱导的心肌细胞凋亡中的作用。方法:(1)抗体的制备:使用公司合成的βi-AR细胞外第二环肽段作为主疫用抗原肽段去主动免疫8周龄的Wistar大鼠。将大鼠随机分成两组:①免疫组:β1-AR-ECⅡ抗原肽段以0.4μg/g的剂量主动免疫大鼠;②溶剂对照组也称伪免疫组。第一次主动免疫时使用完全弗氏佐剂,以后每两周加强免疫一次,换为不完全弗氏佐剂。免疫8 w后进行腹主动脉取血,SA-ELISA法检测血清中β1-AA的抗体滴度,使用亲和层析法对血中的βi-AA进行提纯,用于细胞实验。(2)细胞水平的研究:将细胞(H9c2心肌细胞以及原代心肌细胞)随机分成两组,分别是β1-AA组和阴性IgG对照组。β1-AA组即终浓度为1μM的β1-AA处理细胞不同时间,对照组则以相同剂量的阴性IgG进行同等条件处理。心肌细胞的存活率本实验中使用CCK-8法进行检测,心肌细胞凋亡情况使用Caspase-3试剂盒监测Caspase-3的活性、Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术直接监测凋亡率以及Hoechst 33258染色法致密蓝染凋亡细胞,而心肌细胞自噬水平则使用常规的RT-PCR法及Western blot的方法对自噬相关基因和蛋白进行测定。分别使用Caspase广谱抑制剂Z-VAD-FMK对凋亡进行抑制,经典自噬抑制剂3-MA和mTOR通路抑制剂Rapa抑制和上调自噬,观察减少细胞凋亡以及改变细胞的自噬水平后心肌细胞死亡的变化情况。使用3-MA和Rapa对心肌细胞进行预处理,下调和上调自噬水平,采用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术、Hoechst 33258染色、Caspase-3活性改变以及JC-1染色情况观察心肌细胞凋亡情况的改变。结果:1.β1-AA诱导的心肌细胞凋亡参与了心肌细胞死亡1.1常规复苏以及传代培养后的H9c2心肌细胞可用于后续实验37℃水浴锅中迅速融化冻存液并以800 rmp的速度离心细胞,弃去上清冻存液,使用培养基重悬细胞后接种在细胞培养瓶,孵箱培养,待其密度达到约80%,0.25%不含有EDTA的胰蛋白酶消化细胞进行传代,常规细胞培养便于后续实验使用。1.2分离培养的原代乳鼠心肌细胞活性好,纯度高,药物反应敏感使用提前配置的浓度为0.4%的台盼蓝染液对刚分离的原代细胞的存活率进行检测,经检测,其存活率高达90%;待细胞生长4天后,采用心肌细胞标志物α-横纹肌肌动蛋白(α-actin)及心肌肌钙蛋白I(cTnI)对所分离的细胞进行免疫荧光染色鉴定,结果证明分离的心肌细胞纯度高达92.64%;使用临床常用药物异丙肾上腺素和去甲肾上腺素刺激原代乳鼠心肌细胞,发现细胞对两种药物的反应敏感。1.3主动免疫大鼠血清中提纯的β1-AA能够增加乳鼠心肌细胞的跳动频率采用SA-ELISA方法检测主免大鼠6周后大鼠血清中β1-AA的OD值,结果发现其OD值高达1.93±0.26,提纯后浓度高达6.4 mg/mL。将β1-AA作用于培养4天的原代心肌细胞,结果发现1 μM的β1-AA作用于原代心肌细胞24 h及48 h后心肌细胞的跳动频率明显增加,表明主免大鼠后其血清中提纯的β1-AA具有活性,能够增加乳鼠心肌细胞的跳动频率。1.4 β1-AA可以降低心肌细胞的存活率采用CCK-8法反映β1-AA对心肌细胞存活率造成的影响。结果显示β1-AA刺激心肌细胞48 h,心肌细胞存活率下降最为显著。1.5 β1-AA能够诱导心肌细胞凋亡使用Caspase-3活性检测,Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术和Hoechst 33258染色检测细胞凋亡情况的变化。三种方法检测结果类似,显示β1-AA作用于心肌细胞6 h,心肌细胞的凋亡显著增加,说明β1-AA能够诱导心肌细胞发生凋亡。1.6采用Caspase的广谱抑制剂Z-VAD-FMK抑制凋亡后可以部分逆转β1-AA诱导的心肌细胞死亡用Caspase的广谱抑制剂Z-VAD-FEK对心肌细胞进行30 min预处理,再使用β1-AA刺激心肌细胞,结果显示Z-VAD-FEK可以部分逆转β1-AA诱导的Caspase-3活性增加、减少β1-AA诱导的心肌细胞死亡。这一结果提示,β1-AA诱发的细胞凋亡参与了其细胞损伤作用。2.β1-AA引起心肌细胞自噬水平变化的时间规律及其在心肌细胞死亡中的意义2.1 β1-AA诱导心肌细胞的自噬出现先增高后降低的趋势采用Real time-PCR法及Western blot法测定β1-AA干预H9c2心肌细胞0 h、3 h、6h、12h、24h后自噬相关蛋白LC3的mRNA水平以及LC3、Beclin1和P62蛋白表达情况;分离原代乳鼠心肌细胞,用β1-AA刺激0min,1min,3min,5min,10 min,20 min,30min,1 h,3 h,6 h,12 h,24 h,36 h,48 h 和 72 h 后检测 LC3的mRNA水平以及LC3、Beclin1和P62蛋白表达情况。结果均提示β1-AA可以诱导心肌细胞自噬水平出现先增高后降低的趋势。2.2自噬水平降低是β1-AA引起心肌细胞死亡的重要原因分别采用3-MA和Rapa预处理心肌细胞,发现3-MA预处理致自噬水平下调后心肌细胞的存活率与β1-AA单独处理组的心肌细胞相比进一步下降;而Rapa预处理上调自噬水平后心肌细胞的存活率部分恢复。提示我们自噬水平下降参与了β1-AA引起的心肌细胞死亡。3.自噬的下降在β1-AA诱导的心肌细胞凋亡中的作用研究3.1 Rapa上调或3-MA下调心肌细胞自噬水平可以明显改变β1-AA诱导的心肌细胞凋亡检测Caspase-3活性变化,Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术观察凋亡率改变以及Hoechst 33258染色法蓝染凋亡细胞核。结果显示3-MA+β1-AA组与.单独β1-AA处理组心肌细胞相比,凋亡率进一步提高,这表明抑制自噬可增加心肌细胞的凋亡。而Rapa+β1-AA组与单独β1-AA处理组心肌细胞相比,细胞凋亡率显著下降,表明上调自噬可减少原代心肌细胞凋亡。这些结果都提示自噬水平的降低参与β1-AA引起的心肌细胞凋亡。3.2降低的自噬能够促进β1-AA诱导的心肌细胞线粒体途径的凋亡JC-1荧光染色显示的红绿荧光强度以及Caspase-9活性的改变与线粒体凋亡密切相关。两种方法结果显示,3-MA预处理组与β1-AA单独处理组相比,Caspase-9活性进一步升高,JC-1染色绿色荧光与红色荧光比值显著提高,表明线粒体去极化,线粒体途径的凋亡大幅增加;Rapa预处理组与β1-AA单独处理组相比,Caspase-9活性则有所回降,而JC-1染色显示Rapa预处理细胞后可以使细胞保持基本的线粒体膜电位,提示β1-AA诱导自噬的下降可能是通过线粒体凋亡途径引起心肌细胞凋亡增加。结论:自噬水平的下降参与了β1-AA诱导的心肌细胞凋亡。