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研究目的:1、建立TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR技术,检测外周血中T细胞受体重排删除环(TRECs)的含量。2、探讨T细胞受体重排删除环(TRECs)的含量与CD31+调节性T淋巴细胞检测在评价慢性乙型肝炎患者胸腺新近输出功能的临床应用价值。研究方法:1、根据T细胞受体(TCR)基因序列设计引物与探针,建立TaqMan-MGB标记探针技术定量检测外周血中TRECs的含量,通过重复性、敏感性、准确性实验评价该方法的可靠性。2、选择105例慢性乙型肝炎患者和30例健康体检者分为四组:轻度慢性乙型肝炎患者(Mild HBV)组35例、中度慢性乙型肝炎患者(Moderate CHB)组35例,重度慢性乙型肝炎患者(Severe CHB)组35例,健康对照(HCs)组30例,利用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC),采用CD31作为胸腺新近输出功能的细胞表面标志物,通过流式细胞分析法检测各组外周血中CD31+Treg/Treg细胞的百分比,应用TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR技术检测PBMC中T细胞受体重排删除环(TRECs)的数量,采用Spearman相关性检验分析CD31+Treg/Treg百分比与PBMC中TRECs数量间的相关性。同时进行常规CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+检测,对三组慢性乙型肝炎患者进行ALT,HBV-DNA及乙肝免疫标志物检测。研究结果:1.通过多次试验成功建立了检测TRECs含量的TaqMan-MGB标记探针实时荧光定量检测方法,并对5×105Copies的质粒进行10倍法稀释,最低检出限可达50 Copies;对6.18ULgCopies/106BMCs 和 3.54 LgCopies/106PBMCs 高低浓度标本同一批次进行25次检测结果平均值为6.08±0.14,3.52±0.18Lg Copies/106BMCs批内变异系数分别为2.26%,5.12%,对这两份标本连续4天重复20次试验结果平均值为 6.10±0.23,3.51±0.22LgCopies/106PBMCs 批间变异系数分别为 3.85%,6.27%;对已确认阳性的解脲支原体DNA,沙眼衣原体DNA,疱疹病毒2型DNA,淋球菌 DNA,HBVDNA(UUDNA,CTDNA,HSV2DNA,NGDNA,HBVDNA)各5例以及双蒸水代替模板进行检测均无目的基因扩增。2.四组PBMC中TRECs数量比较severe CHB组PBMC中TRECs数量为3.53±0.66 LgCopies/106PBMC,明显低于 mild CHB 组 4.57±0.52 LgCopies/106PBMC,p<0.001 和 HCs 组 4.82±0.75 LgCopies/106PBMC,p<0.001;Moderate CHB 组 PBMC 中 TRECs 数量为 4.08±0.58 LgCopies/106PBMC,较 Severe CHB 组高,较mild CHB组低;Mild CHB组PBMC中TRECs数量虽然低于HCs组两组间差异无统计学意义(p>0.05)。3.四组CD31+Treg/Treg百分比的比较severe CHB组外周血CD31+Treg/Treg 百分比为(12.25%±2.35%),明显低于 mild CHB 组(16.35%±3.35%,p=0.002)和 HCs 组(17.75%±3.82%,p<0.001);Moderate CHB 组外周血 CD31+Treg/Treg百分比为(14.38%±2,77%),介于 Severe CHB 组与 mild CHB 组之间;Mild CHB组外周血CD31+Treg/Treg百分比虽然低于HCs组,但两组间差异无统计学意义(p=0.098)。4.四组CD3+、CD4+、CD8+淋巴细胞百分比的比较 外周血CD3+、CD4+、CD8+淋巴细胞百分比各组间略有不同,在severe CHB组中CD4+淋巴细胞百分比最低,CD8+淋巴细胞百分比最高,moderate CHB表现的次之;但CD3+、CD4+、CD8+淋巴细胞百分比在四组中无统计学差异p>0.05;CD4+/CD8+比值moderate CHB组和severe CHB组明显低于mild CHB组和HCs组并且存在统计学差异p<0.05,而在mild CHB组和HCs组中无统计学差异p>0.05。5.105份慢性乙型肝炎患者根据ALT值、HBVDNA含量、HBeAg阴阳分组在ALT<2ULN组和ALT≥2ULN组,两组间TRECs数量比较呈现ALT≥2ULN组的TRECs含量明显低于ALT<2ULN组,存在统计学差异p<0.05;CD31+Treg/Treg百分比同样在ALT≥2ULN组低于ALT<2ULN组,两组数据存在统计学差异p<0.05;HBVDNA<102IU/ml,102≤HBVDNA<105 IU/ml,HBVDNA>105 IU/ml三组,三组间TRECs数量和CD31+Treg/Treg百分比均无统计学差异p>0.05;HBeAg阳性组和HBeAg阴性组,两组间TRECs数量和CD31+Treg/Treg百分比均无统计学差异p>0.05。6.105份标本外周血CD31+Treg/Treg百分比与PBMC细胞中TRECs数量呈正相关(r=0.551,p=0.014)。研究结论:1.成功建立了 TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR技术检测外周血TRECs含量。2.CD31+Treg/Treg、TRECs含量在慢性乙型肝炎中度患者和重度患者中是减少的,表明慢性乙型肝炎中度和重度患者的胸腺新近输出功能降低。3.CD31+Treg/Treg、TRECs 含量与 ALT 活性有关,与 HBVDNA 含量、HBeAg阴阳无关。4.CD31+Treg/Treg与TRECs含量呈正相关,是评价胸腺新近输出功能的新指标。