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目的:细胞凋亡的失衡与肿瘤发生发展密切相关,其失衡在不同的肿瘤细胞中有不同的表现。凋亡调节蛋白在恶性肿瘤细胞中的作用是当前研究热点之一,在目前已知的三条凋亡信号传导通路中,凋亡抑制蛋白、凋亡促进蛋白有着重要作用。XIAP是凋亡抑制蛋白家族中的一员,它可以通过抑制caspase-3,6,7,9的激活,从而阻断细胞凋亡。Omi/HtrA2是一种促凋亡因子,可通过抑制凋亡抑制蛋白(IAPs)、活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspases)途径和丝氨酸蛋白酶途径促进细胞凋亡。目前有关XIAP、Omi/HtrA2在宫颈癌细胞系(HeLa)中的相互作用未见报道。本实验旨在探讨:(1)XIAP、Omi/HtrA2分别在HeLa细胞中的作用(2)米非司酮诱导HeLa细胞调亡的作用(3)XIAP、Omi/HtrA2的相互作用。以期达到为宫颈癌的治疗提供新靶点。
方法:研究对象为人宫颈癌细胞系(HeLa)。采用:(1)XIAP、Omi/HtrA2重组质粒DNA的提取。(2)通过培养HeLa细胞、细胞转染,利用荧光显微镜观察XIAP、Omi/HtrA2在细胞内的表达和定位。(3)通过细胞转染、米非司酮干扰(未处理组、对照组、空白对照组、实验组),用流式细胞术(FCM)检测HeLa细胞的凋亡情况。(4)共聚焦显微镜检测XIAP、Omi/HtrA2的相互作用以及药物干预作用。
结果:(1)DsRed2-XIAP、EGFP-Omi/HtrA2、DsRed2-Omi/HtrA2融合蛋白在HeLa细胞中的定位主要表现为弥漫性地分布在细胞核和细胞浆。(2)转染了重组质粒pDsRed2-XIAP、pEGFP-Omi/HtrA2、pDsRed2-Omi/HtrA2的HeLa细胞,用FCM检测,其凋亡率分别是:未处理组为0.10%,转染pDsRed2-Omi/HtrA2的HeLa细胞凋亡率为32.69%。(3)在转染了重组质粒pDsRed2-XIAP、pEGFP-Omi/HtrA2、pDsRed2-Omi/HtrA2的HeLa细胞中,加入米非司酮(40umol/L),于4h后收集细胞,其凋亡率分别是:①未处理的HeLa细胞为0.10%,②对照组(只加米非司酮)46.16%。③空白对照组(米非司酮+转染空质粒pDsRed2-N1)49.05%,④实验组1(米非司酮+转染质粒pDsRed2-XIAP)26.41%,⑤实验组2(米非司酮+转染质粒pDsRed2-Omi/HtrA2)78.85%,⑥实验组3(米非司酮+转染质粒pDsRed2-Omi/HtrA2+转染质粒pDsRed2-XIAP)64.15%。(4)用488nm的激发波,可在565nm的发射波下记录到部分细胞的红色荧光,当作为受体的DsRed2-XIAP荧光漂白后作为供体的EGFP-Omi/HtrA2荧光增强,FRET效率为9.30,说明在XIAP、Omi/HtrA2在HeLa细胞中存在能量共振转移现象。
结论:(1)融合蛋白DsRed2-XIAP、EGFP-Omi/HtrA2、DsRed2-Omi/HtrA2在HeLa细胞中的定位为弥漫分布在细胞核和细胞浆。(2)米非司酮能促进Hela细胞凋亡;DsRed2-XIAP融合蛋白能够抑制由米非司酮诱导的HeLa细胞凋亡;DsRed2-Omi/HtrA2融合蛋白能够促进HeLa细胞凋亡,米非司酮能增加Omi/HtrA2促凋亡作用,Omi/HtrA2与米非司酮在HeLa细胞凋亡中存在协同作用;DsRed2-Omi/HtrA2、DsRed2-XIAP共转染能促进由米非司酮诱导的HeLa细胞凋亡,Omi/HtrA2可减弱XIAP对Hela细胞凋亡的抑制作用;XIAP、Omi/HtrA2可能是治疗宫颈癌的一个新靶点,米非司酮促HeLa细胞凋亡的作用机制可能与XIAP、Omi/HtrA2有关。(3)在活Hela细胞中,利用FRET技术直接证实XIAP与Omi/HtrA2在部分细胞中存在相互作用。