论文部分内容阅读
【研究背景】 谷氨酸(Glutamate, Glu)兴奋性神经毒性在缺氧-缺血性脑损伤和各种慢性退行性神经病变中起重要作用。如何减轻 Glu兴奋性毒性对上述疾病的治疗具有重要意义。研究表明,谷氨酸的兴奋性毒性与一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase, NOS)的过度活化、一氧化氮(Nitric oxide, NO)的生产增加密切相关。 非对称性二甲基精氨酸(Asymmetric Dimethylarginine, ADMA)是一种广泛参与多种病理生理过程的内源性竞争性 NOS抑制剂。ADMA除能通过抑制NOS活化,减少NO生成外,还能通过诱导NOS失耦联,增加氧自由基(reactive oxygen species, ROS)生成、造成氧化应激损伤。 在Glu兴奋性毒性损伤过程中,ADMA是通过抑制NOS活化、减少NO生成,减轻兴奋性神经毒性,还是通过增加ROS生成,加重兴奋性神经毒性,尚无报道。 【目的】 本试验以Glu损伤PC12细胞作为Glu兴奋性神经毒性的体外模型,探讨ADMA对Glu兴奋性神经毒性作用的影响及其机制。 【方法】 1)四甲基偶氮唑蓝(3-(4,5-Dimethylthiazol-2yl)-2,5-Diphenyl Tetrazolium Bromide, MTT)比色法检测细胞增殖状况; 2)乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)释放试验评价细胞损伤程度; 3)罗丹明123(Rhodamine123, Rh123)染色,荧光显微镜摄片及流式细胞仪(Flow Cytometry, FCM)检测细胞线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential, MMP); 4)双氢罗丹明(Dihydrorhodamin123, DHR)染色,荧光显微镜摄片及FCM检测细胞内ROS水平; 5)NOS检测试剂盒测定细胞NOS活性; 6)NO检测试剂盒测定细胞NO的生成。 【结果】 1. Glu对PC12细胞的兴奋性毒性作用及其机制 1) PC12细胞分别与0.5 mM、1 mM、2 mM、4 mM和6 mM Glu共培养24 hrs,MTT法检测细胞活力显示,在1 mM~6 mM Glu范围内,细胞存活率随药物浓度增加而逐渐降低,呈剂量依赖性关系。 2)1 mM、2 mM、4 mM Glu处理PC12细胞24 hrs,细胞LDH释放增加。 3)2 mM Glu处理4 hrs,MMP明显降低。 4)2mM Glu处理4 hrs,细胞内ROS水平明显增加。 5)Glu处理4 hrs,可使PC12细胞NOS活性增加,1 mM Glu组NOS活性提高了0.6倍,2 mM Glu组NOS活性提高了1倍,4 mM Glu组NOS活性没有继续升高。 6)Glu作用4 hrs,可使PC12细胞NO生成量增加,1 mM Glu组NO生成量增加0.7倍,2 mM Glu组NO生成量增加2倍,4 mM Glu组NO生成量不再继续增加。 2. ADMA抗Glu兴奋性毒性的作用及其机制 1)ADMA(20~320μM)对PC12细胞无明显的毒性作用。 2)不同浓度Glu处理PC12细胞前30 mins,分别给予20μM、40μM ADMA预处理可以对抗1 mM、2 mM和4 mM Glu引起的细胞存活率降低。 3)20μM ADMA预处理可以抑制1、2和4 mM Glu引起的细胞LDH释放。 4)20μM ADMA预处理可改善2 mM Glu引起的MMP降低。 5)20μM ADMA预处理可减少2 mM Glu诱导的ROS堆积。 6)20μM、40μM ADMA预处理可抑制2 mM Glu增加细胞NOS活性。 7)20μM、40μM ADMA预处理可抑制2 mM Glu促进NO生成。 【结论】 ADMA对Glu兴奋性毒性损伤PC12细胞具有保护作用,其机制可能与其抑制NOS过度活化、减少NO生成,进而降低细胞内ROS水平,改善MMP有关。