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【研究目的】褪黑素(melatonin)是哺乳动物松果体分泌的一种激素,分泌量与昼夜节律密切相关。褪黑素分布在血液中,游离至各个部位,通过其在哺乳动物体内的两个主要受体MT1和MT2发挥作用。褪黑素具有维持昼夜节律、促进睡眠的生理作用。近年来,陆续发现褪黑素还有其它重要功能,包括神经保护和自由基清除等。褪黑素对许多神经退行性疾病如阿尔茨海默症、帕金森病、亨廷顿症、肌萎缩性侧索硬化症、以及自闭症等广泛发育障碍的疾病症状有改善作用。学习与记忆能力是人脑的高级功能,大脑内的许多部位都与学习记忆功能相关,其中研究最多的是海马及其邻近结构、大脑皮层、杏仁核、丘脑等。突触可塑性是动物学习与记忆的生物学基础,包括结构和功能的可塑性。在功能可塑性中,长时程增强(LTP)和长时程抑制(LTD)是哺乳动物大脑中主要的长时程突触可塑性形式。除了神经元之间的信号传输外,胶质细胞的修饰和神经生化物质如神经类固醇、神经肽等都能影响到突触可塑性。近年来,有关长时程抑制的研究获得了重大进展,特别是其分子机制的研究和在学习与记忆过程中以及在神经系统认知疾病方面的作用受到广泛关注。长时程抑制的分子机制主要有两个,N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体依赖的LTD和代谢型谷氨酸受体(m Glu R)依赖的LTD,通过不同的通路,都引起α-氨基-3-羧基-5-甲基噁唑-4-丙酸(AMPA)受体从神经元细胞膜向细胞浆内转运,突触后膜兴奋性降低,最终引起LTD。LTD过度增强引起的代表性认知障碍疾病是脆性X综合征,也是一种临床上最常见的遗传性智力低下症。FXS模型小鼠突触可塑性异常,主要表现为结构上树突发育障碍和功能上突触传递紊乱;电生理学研究发现其海马体和前扣带回皮层区域长时程增强明显减弱而长时程抑制显著增强;行为学研究发现其额叶皮层参与的恐惧记忆能力显著降低。褪黑素在学习与记忆功能方面的作用和机制还不明确,已有的报道显示褪黑素能够抑制海马体不同区域的LTP,且这种抑制是通过激动其受体MT2介导的,但褪黑素是否会影响LTD还未见报道。本研究拟以分子生物学和电生理学手段观察褪黑素对神经元兴奋性传递的影响,阐明其对LTD的影响和作用机制,进而探讨其在FXS中的作用,从而为发掘潜在的药物靶点和临床治疗策略提供新的思路以及理论依据。【研究方法】1.体外培养大鼠皮层神经元,使用褪黑素受体MT2激动剂处理神经元,采用免疫印迹技术观察其对神经元中AMPA受体Glu A1和Glu A2亚基磷酸化水平的调节作用。2.采用生物素标记的方法检测MT2拮抗剂和激动剂对体外培养大鼠皮层神经元AMPA受体Glu A1和Glu A2亚基膜上表达水平的调节作用。3.利用全细胞膜片钳技术观察褪黑素对体外培养大鼠海马神经元s EPSC和m EPSC幅度和发放频率的影响;急性分离获得含海马的大鼠脑薄切片,记录褪黑素对CA1区神经元evoked EPSC的影响。4.利用活体在体记录技术观察腹腔注射褪黑素对大鼠CA1区f EPSP的影响。5.使用NMDAR拮抗剂和m Glu R拮抗剂预处理脑片,再给予褪黑素观察evoked EPSC的变化;在给予褪黑素evoked EPSC达稳定后,分别使用NMDAR或m Glu R所依赖的电刺激刺激脑片,观察LTD的变化,探寻褪黑素的作用机制。6.麻醉大鼠腹腔注射MT2拮抗剂和m Glu R拮抗剂,再给予褪黑素观察f EPSP的变化,探寻褪黑素的作用机制。7.采用免疫印迹技术,比较Fmr1 KO小鼠与WT小鼠海马及ACC区域褪黑素受体的表达水平,观察其是否有过表达现象。8.通过定位注射sh RNA,降低Fmr1 KO小鼠中过量表达的褪黑素受体,14天后建立恐惧记忆模型,观察其学习记忆能力的变化。【研究结果】1.激动MT2能降低神经元AMPA受体Glu A1 Ser831位点磷酸化水平,且升高Glu A2 Ser880位点磷酸化水平。2.激动MT2能引起AMPA受体Glu A1和Gl A2亚型在细胞膜上的表达减少,促进其AMPA受体从胞膜向胞浆内转运,而使用MT2选择性抑制剂预处理能抑制这种转运现象。3.褪黑素能显著降低海马神经元s EPSC和m EPSC的幅度和发放频率,即降低神经元的兴奋性突触传递;在脑片中灌流褪黑素会显著降低大鼠海马CA1区神经元evoked EPSC的幅度,引起LTD。4.腹腔注射褪黑素显著减小麻醉大鼠CA1区f EPSP的斜率,引起LTD。5.褪黑素在海马CA1区引起的LTD不受NMDAR拮抗剂的影响,而完全被m Glu R拮抗剂所抑制;当褪黑素诱导LTD达稳定后,使用NMDAR依赖的LFS刺激脑片能进一步诱导LTD,而使用m Glu R依赖的pp LFS刺激脑片不会对之前的LTD产生影响。6.提前给予MT2或m Glu R拮抗剂能完全抑制褪黑素在麻醉大鼠海马CA1区引起的LTD。7.在Fmr1 KO小鼠与WT小鼠海马区褪黑素受体表达水平无显著差异,但在Fmr1KO小鼠ACC区MT2过度表达。8.下调Fmr1 KO小鼠ACC区MT2的表达能显著改善Fmr1 KO小鼠的恐惧记忆能力。【研究结论】1.褪黑素通过激动MT2在神经元中能引起AMPA受体从包膜向胞浆内转运,诱导产生LTD。2.褪黑素诱导LTD机制与Group I m Glu R-LTD机制相同。3.Fmr1 KO小鼠ACC区MT2过度表达,下调MT2的过度表达可部分纠正模型动物的行为学表征。