植物根际土壤中稀有放线菌的选择分离、鉴定及其生物活性研究

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天然产物是新药制备的重要原料,绝大多数来源于微生物的天然产物都分离自放线菌,尤其是链霉菌。链霉菌是放线菌的重要组成成员,能合成结构类型丰富、生物活性多样的次级代谢产物,可用于创制抗生素、抗肿瘤药物、免疫抑制药物、抗虫药物等,在医疗、农业、食品等领域具有重要的应用价值。然而,随着对链霉菌持续的开发利用,目前从链霉菌中发现新型、高活性的次级代谢产物的几率在不断下降,来源于链霉菌的新药研发速度明显放缓。为了解决链霉菌活性次级代谢产物资源日趋枯竭的问题,人们将目光转向了与链霉菌一样能够产生丰富次生代谢产物的非链霉菌属的稀有放线菌资源。稀有放线菌广泛分布于植物根际中,植物根际的特殊微生态环境造就了根际稀有放线菌不仅数量多、种类多样性丰富,而且有可能形成了有别于非根际微生物的独特代谢途径。因此,根际稀有放线菌具有产生新型、高活性次级代谢产物的巨大潜力,是一类值得深入研究与开发的药用微生物资源。本论文对植物根际土壤中的放线菌进行分离、鉴定以及生物活性评价,旨在为植物根际放线菌,尤其是稀有放线菌的开发利用提供资源和科学依据。  本论文针对拟无枝酸菌属设计了特异性引物,并对采集自福建、浙江、广西、山东、云南这5省的45份植物根际土壤样品进行了快速筛选,获得了4份拟无枝酸菌属丰度较大的植物根际土壤样品用于后续分离。使用PLA培养基和YZ培养基,从上述4份阳性土壤样品中共分离得到301株放线菌,其中168株分离自PLA培养基,133株分离自YZ培养基;75株分离1号土壤,59株分离自2号土壤,89株分离自38号土壤,78株分离自44号土壤。  根据菌株形态和抗菌活性结果,对排重后的166株菌进行16S rRNA分子鉴定。测序结果显示,有73株为稀有放线菌,占供测菌株的44.0%,其余为链霉菌属菌株。稀有放线菌归入17个属:野野村菌属(Nonomuraea)16株,放线马杜拉菌属(Actinomadura)13株,拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)11株,链孢子囊菌属(Streptosporangium)10株,壤霉菌属(Agromyces)5株;诺卡氏菌属(Nocardia)4株,微杆菌属(Microbacterium)3株,拟无枝酸菌属(Amycolatopsis)2株,糖单胞菌属(Saccharomonospora)1株,壤球菌属(Agrococcus)1株,栖白蚁菌属(Isoptericola)1株,小单孢菌属(Micromonospora)1株,分枝菌属(Mycobacterium)1株,珊瑚放线菌属(Actinocorallia)1株,微球菌属(Micrococcus)1株,小四孢菌属(Microtetraspora)1株,红球菌属(Rhodococcus)1株。  本论文还使用固体和液体两种发酵方式对206株放线菌进行了小量发酵,并测定其412份发酵粗提物的抗菌和抗肿瘤活性。采用滤纸片法,分别以金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、大肠杆菌、黑曲霉和白色假丝酵母作为指示菌进行抗菌活性测定。所测定的206株菌当中,有157株菌对一种或多种指示菌表现出抗菌活性,占供测菌株的76.2%,其中有54株为稀有放线菌。采用MTT法,以人乳腺癌细胞MCF-7、人骨肉瘤细胞U2OS、人肝癌细胞HepG2、人食管癌细胞kyse-450、人早幼粒白血病细胞HL-60、人套细胞淋巴瘤细胞JEKO-1、人恶性黑色素瘤细胞A375、人肺癌细胞A549、人胃腺癌细胞BGC823这九种肿瘤细胞系为指示细胞株进行抗肿瘤活性测定,筛选到113株放线菌对一种或多种肿瘤细胞具有抑制作用,占供测菌株的54.9%,其中有37株为稀有放线菌。  研究结果显示,植物根际土壤中链霉菌及稀有放线菌资源丰富,且菌株中有不少具有高抗菌和抗肿瘤活性,表明植物根际放线菌是一类极具潜在开发价值的药用微生物资源。
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