论文部分内容阅读
原发性肝癌（primary hepatic carcinoma，PLC）是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一。肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC，简称肝癌）则是其中最常见的一种类型，其发病率位居恶性肿瘤中第五位，并且是癌症相关性死亡的三大常见原因之一，目前已成为全球性关注的健康问题。我国肝癌主要发病因素为肝炎病毒感染包括慢性乙型肝炎病毒（HBV）以及丙型肝炎病毒（HCV）感染、长期大量饮酒、黄曲霉毒素污染的食物及一些其他肝脏代谢疾病等。肝癌发病比较隐匿，病情进展十分迅速。早期一般没有症状或者症状并不十分明显，确诊时大多数的患者已达局部晚期或已发生远处转移，治疗难度大，预后差。当前肝癌的诊断金标准主要是病理学诊断，但这在临床上并不实用。故目前得到国内外共识的临床诊断标准主要取决于三个因素，即影像学检查、血清AFP水平以及慢性肝病病史。AFP作为肝癌相对特异的血清肿瘤标志物，其持续升高是发生肝癌的危险因素，但其诊断阳性率一般仅为60%~70%。近年来，一些欧美学者指出AFP作为肝癌肿瘤标记物其特异性及敏感性并不高。当前肝癌的首选治疗依然为外科手术，但是在确诊时大部分患者已经达到中晚期，往往失去了手术的机会，仅有不到20%的患者适合手术治疗。并且由于射频消融、粒子植入、TACE等治疗有其一定的局限性，效果并不令人十分满意。因此通过研究肝癌的发生、发展机制，寻找新的分子标志物以便提高肝癌的诊断率，同时可针对肿瘤进行分子靶向治疗的意义十分重大。多形性腺瘤基因1（pleomorphic adenoma gene1，PLAG1）是位于人染色体8q12的原癌基因，包含5个外显子，cDNA全长7313bp，基因库编号为U65002，其中只有第4外显子的最后端和第5外显子的起始端进行编码，编码框共1503bp。最早是在多形性腺瘤组织中被发现。本研究分别采用了实时荧光定量PCR（Real-time PCR）技术和酶联免疫吸附法（ELISA）检测正常人血浆、肝硬化患者血浆和肝癌患者血浆中PLAG1mRNA及蛋白表达水平的差异，并分析其表达与临床病理参数之间的关系。材料与方法1．材料实验组选择2012年04月-2012年12月河南省人民医院肝胆外科住院的肝癌患者62例，其中男性42例，女性20例，年龄34-78岁，平均年龄（54.2±11.1）岁。所有肝癌患者诊断均经过病理证实，收集标本时均未进行手术治疗、放疗及化疗。对照组45例为河南省人民医院消化内科住院的肝硬化患者，并经影像学检查排除肝癌；另40例为本院同期同年龄段健康体检者。所有受试者均获得知情同意。2．方法2.1Real-time PCR：分别提取正常对照者、肝硬化患者和肝癌患者血浆中总RNA，经1%琼脂糖凝胶电泳（150V，15min）检测RNA28S和18S比例，并应用紫外分光光度计检测A260/A280测定总RNA吸光度，以评估总RNA完整性和纯度。按照RT-PCR试剂盒的操作步骤进行反转录PCR，应用所得CT值计算扩增产物相对定量，同时应用4%的琼脂糖凝胶电泳进行扫描和分析验证PLAG1DNA扩增产物的正确性。2.2ELISA检测各组标本均按照PLAG1-ELISA试剂盒说明书进行操作，测出OD值。然后根据标准品应用Excel2007软件绘制标准曲线,通过已知标准品浓度值计算样品浓度值。3．统计学处理采用SPSS17.0统计学软件，各组表达差异采用χ2检验，相对表达量采用中位数（最小值，最大值）表示。多组定量资料运用Kruskal-Wallis秩和检验。ELISA计量资料采用mean±SD表示，组间定量资料运用t检验和方差分析及LSD-t检验。以α=0.05为检验标准。结果1．Real-time PCR：各组总RNA提取结果良好，电泳证实提取的是高纯度RNA，完整性较好，总RNA吸光度在A260/A280在1.5-1.9之间，符合纯度要求。PLAG1mRNA阳性表达率在肝癌组、肝硬化组和正常对照组中分别为75.8%，20.0%，7.5%，肝癌组血浆中PLAG1mRNA的阳性表达率明显高于肝硬化组及正常对照组，肝癌组与肝硬化组、正常对照组之间的差异有统计学意义（P均＜0.05）。而肝硬化组与正常对照组差异无统计学意义（P＝0.099）。肝癌组PLAG1mRNA的相对定量为45.25（9.85，207.94），肝硬化组为11.31（5.66，51.98），正常对照组为12.99（1.00，18.38），三组之间差异有统计学意义（P=0.001）。两两比较，肝癌组与肝硬化组、正常对照组之间的差异均有统计学意义（P均＜0.05）。肝硬化组与正常对照组之间的差异无统计学意义（P＞0.05）。肝癌组血浆中不同分化程度和不同临床分期的PLAG1mRNA表达差异有统计学意义。2．蛋白表达PLAG1蛋白含量在肝癌组、肝硬化组及正常对照组中分别为118.61±10.91pg/ml、61.41±6.85pg/ml、59.63±7.04pg/ml。患者血浆PLAG1含量明显高于肝硬化组和正常对照组(P＜0.05)。两两比较，肝癌组与肝硬化组及正常对照组均有统计学意义(P＜0.05），肝硬化组与正常对照组比较无统计学意义（P=0.35）。肝癌组中，PLAG1含量与TNM分期相关，发生远处转移组的PLAG1含量明显高于未发生转移组。结论1．PLAG1mRNA和蛋白在肝癌患者血浆中明显高表达，并高于肝硬化组及正常对照组，提示其可能在肝癌的发生、发展过程中发挥着重要的作用。2．PLAG1的表达水平与病理分化程度及临床分期密切相关，分化程度越低，PLAG1表达越强，并与肝癌远处转移的发生密切相关。有望成为诊断肝癌及判断肝癌转移、提示预后不良的临床指标。