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目的:探讨金丝桃苷(Hyperoside,Hyp)改善大鼠心肌缺血再灌注损伤(Myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI)与心肌组织PKC(Protein kinase C)/mitoKATP(mitochondrial ATP channel)信号通路之间的关系。方法:1.在体实验:健康雄性SD大鼠72只适应性喂养一周后,采用结扎冠状动脉左前降支制备大鼠急性心肌缺血再灌注损伤(MIRI)模型,随机分为9组,分别是假手术组(Sham)、模型组(MIRI)、金丝桃苷组(Hyp,50 mg/kg)、Hyp+PKCα阻断剂BisI组(50 mg/kg+2.5 mg/kg)、Hyp+PKCε阻断剂CHE组(50mg/kg+8 mg/kg)、Hyp+mitoKATP阻断剂5-HD组(50 mg/kg+10 mg/kg)、PKCα抑制剂BisI组(2.5 mg/kg)、PKCε抑制剂CHE组(8 mg/kg)、mitoKATP抑制剂5-HD组(10 mg/kg)。除Sham、MIRI组大鼠给予生理盐水(Normal saline,NS)灌胃外,Hyp组及Hyp联用各抑制剂组均给予Hyp 50 mg/kg,灌胃10天。于第10天灌胃结束后,Hyp联用各抑制剂组及各单用抑制组于术前1 h腹腔注射上述各相应抑制剂。采用BL-420生物机能采集系统记录仪记录在缺血前,缺血30 min及再灌注2 h的大鼠心电图;再灌注2 h后腹主动脉取血,离心分离血清,运用ELISA法检测大鼠心肌损伤标志物肌酸激酶同工酶(CK-MB)和超氧化物歧化酶(SOD)活性,氧化应激标志物丙二醛(MDA)以及腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)含量;采用HE、TTC及TUNEL染色观察大鼠心肌组织病理学变化、心肌梗死面积及心肌细胞凋亡率。运用蛋白印迹免疫分析法(Western blot,WB)分别观察Hyp及PKCα、PKCε、mitoKATP特异性信号通路抑制剂对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌组织中Nrf2、Caspase-3、PKCε及Kir6.2蛋白表达水平的影响。2.离体实验:体外细胞培养H9c2心肌细胞,随机分为9组,分别是正常组(Normal)、缺氧复氧组(Model)、Hyp组(50μmol/L)、Hyp+PKCα阻断剂BisI组(50μmol/L+1μmol/L)、Hyp+PKCε阻断剂CHE组(50μmol/L+4μmol/L)、Hyp+mitoKATP抑制剂GB组(50μmol/L+3 nmol/L)、PKCα抑制剂BisI组(1μmol/L)、PKCε抑制剂CHE组(4μmol/L)、mitoKATP抑制剂格列本脲(GB)组(3 nmol/L)。运用ELISA法检测缺氧复氧H9c2心肌细胞上清ATP和MDA含量及SOD和CK-MB活性。采用蛋白印迹免疫分析法分别观察Hyp及PKCα、PKCε、mitoKATP信号通路抑制剂对H9c2心肌细胞中Nrf2、Caspase-3、PKC?及Kir6.2蛋白表达水平的影响;采用流式细胞仪检测Hyp及PKC/mitoKATP信号通路抑制剂对缺氧复氧H9c2心肌细胞凋亡程度的影响;采用激光共聚焦技术检测Hyp及PKC/mitoKATP信号通路阻断剂对缺氧复氧H9c2心肌细胞Ca2+浓度的变化。结果:1.在体实验:(1)与Sham组相比,MIRI组大鼠在心肌缺血再灌注期间ST明显抬高(P<0.01),肉眼可见结扎区心室壁呈灰白色,再灌注后ST段逐渐回落,表明造模成功。(2)ELISA检测法结果显示,与Sham组相比,MIRI组大鼠血清中MDA含量、CK-MB活性显著升高,SOD活性与ATP含量均显著降低(P<0.01);与MIRI组比较,Hyp可显著降低血清MDA含量和CK-MB活性,升高SOD活性及ATP含量(P<0.01)。相比于Hyp组,Hyp联用各抑制剂组大鼠血清中MDA含量明显升高,SOD活性及ATP含量均显著降低(P<0.05,P<0.01);相比于各相应单用抑制剂组,Hyp联用各抑制剂组大鼠血清中MDA含量和CK-MB活性下降,SOD活性及ATP含量上调(P<0.01)。(3)HE染色结果显示,MIRI组心肌前壁可见大面积白色区域,嗜酸性变明显,细胞排列紊乱,细胞质充血,淡染;TUNEL染色结果显示,MIRI组大鼠心肌细胞凋亡指数明显上升;TTC染色结果显示,MIRI组心肌梗死面积较大。而用药后,与MIRI组比较,Hyp组及Hyp联合各阻断剂组心肌组织的病理损伤均明显好转,心肌细胞凋亡指数明显下降,心肌梗死面积显著减少。与Hyp组比较,Hyp联合各阻断剂组病理损伤仍较明显。(4)Western blot结果显示,相比于Sham组,MIRI组大鼠心肌组织中Nrf2、PKCε蛋白表达水平明显下降(P<0.01),Kir6.2蛋白表达无明显变化(P>0.05),Caspase-3蛋白表达水平明显上升(P<0.01)。相比于MIRI组,Hyp组大鼠心肌细胞中Nrf2、PKCε、Kir6.2蛋白表达水平明显上升(P<0.01),Caspase-3蛋白表达水平明显下调(P<0.01)。相比于Hyp组,Hyp联用各抑制剂组的Nrf2、PKCε及Kir6.2蛋白表达水平均有一定程度的下调(P<0.05,P<0.01),Caspase-3蛋白表达水平有一定程度的上调(P<0.05);相比于各相应单用抑制剂组,Hyp联用各抑制剂组的Nrf2、PKCε、Kir6.2蛋白表达水平均有一定程度的上调(P<0.05,P<0.01),Caspase-3蛋白表达水平有一定程度的下调(P<0.01)。2、离体实验:(5)ELISA检测法结果显示,与Normal组相比,Model组H9c2心肌细胞上清中MDA含量及CK-MB活性显著升高,SOD活性及ATP含量均显著降低(P<0.01);与Model组比较,Hyp可显著降低缺氧复氧H9c2心肌细胞上清中MDA含量及CK-MB活性,升高SOD活性及ATP含量(P<0.01)。相比于Hyp组,Hyp联用各抑制剂组H9c2心肌细胞上清中ATP含量明显降低(P<0.05);相比于各相应单用抑制剂组,Hyp联用各抑制剂组H9c2心肌细胞上清中MDA含量及CK-MB活性显著降低,SOD活性及ATP含量明显升高(P<0.01)。(6)相比于Normal组,Model组H9c2心肌细胞中Nrf2、PKCε蛋白表达水平明显下降(P<0.01),Kir6.2蛋白表达无明显变化(P>0.05),Caspase-3蛋白表达水平明显上升(P<0.01)。相比于Model组,Hyp组缺氧复氧H9c2心肌细胞中Nrf2、PKCε、Kir6.2蛋白表达水平明显上升,Caspase-3蛋白表达水平明显下调(P<0.01)。与Hyp组相比,Hyp联用各抑制剂组H9c2心肌细胞Nrf2、PKCε、Kir6.2蛋白表达水平有一定程度下调(P<0.05,P<0.01),Caspase-3蛋白表达水平有一定程度上调(P<0.01)。相比于各相应单用抑制剂组,Hyp联用各抑制剂组H9c2心肌细胞Nrf2、PKCε及Kir6.2蛋白表达水平明显上升(P<0.05,P<0.01),Caspase-3蛋白表达水平明显下调(P<0.01)。(7)流式细胞仪检测结果显示,相较于Normal组,Model组H9c2心肌细胞凋亡率显著升高(P<0.01);相较于Model组,Hyp组H9c2心肌细胞凋亡率呈下降趋势(P<0.01);与Hyp组比较,Hyp联用各抑制剂组细胞凋亡率均显著提高(P<0.05,P<0.01);相比于各相应抑制剂组,Hyp联用各抑制剂组心肌细胞凋亡率显著降低(P<0.05,P<0.01)。(8)激光共聚焦检测结果显示,相比于Normal组,Model组H9c2心肌细胞Ca2+荧光强度明显上升(P<0.01);相比于Model组,Hyp组心肌细胞Ca2+荧光强度显著下降(P<0.01);相较于Hyp组,Hyp联用各阻断剂组H9c2心肌细胞的Ca2+荧光强度明显上升(P<0.05)。相比于各相应单用抑制剂组,Hyp联用各抑制剂组H9c2心肌细胞Ca2+荧光强度显著降低(P<0.05,P<0.01)。结论:Hyp具有改善MIRI大鼠心肌组织损伤的作用,其机制可能与其激活大鼠心肌组织PKC/mitoKATP信号通路有关,进一步研究发现,其可能一方面是直接激活PKCα信号通路,另一方面是通过激活PKCε,继而开放mitoKATP通道,调节多种心肌细胞及其亚细胞的结构和功能,清除氧自由基,维持线粒体功能,恢复能量代谢,抑制Ca2+流向胞内,减少心肌细胞凋亡,从而发挥改善心肌损伤的保护作用。