目的肝性脑病是肝硬化的严重并发症之一。其预后极差,发病率高,是肝硬化常见的死亡原因。至今肝性脑病的确切发病机制尚不完全清楚,围绕其机制,学者们提出了几种不同的假说,最主要的是氨中毒学说。肝性脑病时存在不同程度的脑水肿,血氨升高可以促进肝性脑病的发生,并可以使脑水肿加重。目前对于脑水肿的研究表明,血管源性脑水肿和细胞毒性脑水肿是主要的发病机制,这两种发病机制同时参与肝硬化时脑水肿的形成过程。其中血管源性脑水肿发生以血脑屏障(BBB)通透性的改变为主要原因。在BBB的结构中最重要的是紧密连接(tight junction, TJ),其完整性直接影响BBB的功能。在TJ复合物中,occludin蛋白是主要的功能调节蛋白,主要在脑血管内皮细胞中表达,是TJ完整性的最敏感和最可靠的标志。近年来在慢性肝病中BBB中TJ相关蛋白的研究还很少。本研究应用肝硬化动物模型,在氨负荷的作用下来研究脑组织occludin蛋白的表达与脑水肿关系。材料与方法实验动物为健康雄性(SD)大鼠,将大鼠随机分为4组：正常组：无干预因素；正常氨负荷组：实验末给予氨负荷；肝硬化组：制备肝硬化模型,不加外界干预因素；肝硬化氨负荷组：制备肝硬化模型,实验末给予氨负荷。本实验通过腹腔注射四氯化碳橄榄油溶液制备肝硬化动物模型。1、血氨的检测：四组大鼠在给予氨负荷前及30分钟后分别经内眦静脉应用抗凝管采血1ml,并在半小时内应用vitors AMON干片比色法测定血氨水平。2、模型的制备和判断：给药后2小时观察大鼠状态,观察是否出现角膜反射及翻转反射判断肝性脑病的发生。3、血脑屏障通透性的检测：注射伊文思蓝溶液2小时后处死大鼠,取脑组织溶于甲酰胺,离心后取上清液,于波长632nm进行比色,根据标准曲线计算出脑组织EB含量,检测BBB通透性的变化。4、脑水含量的检测：注射伊文思蓝溶液2小时后处死大鼠,完整取出脑组织,干湿重法检测脑水含量。5、苏木素-伊红(H-E)染色镜下观察肝脏及脑组织切片：取大脑及肝右叶组织,应用40%多聚甲醛固定。常规H-E染色,显微镜观察肝脏、脑组织的改变。6、应用免疫组化技术检测occludin蛋白在脑组织中的分布与表达：血管内皮细胞胞浆内棕褐色染色或细胞浆内沿胞膜有棕褐色线形染色为阳性细胞。7、应用Western blot方法对occludin蛋白的表达作半定量分析。8、所有数据均以x±s表示,应用SPSS11.5软件进行方差分析,p值小于0.05认为差异有统计学意义。结果1、模型制备情况：正常组、正常氨负荷组及肝硬化组角膜反射与翻转反射存在,未出现肝性脑病；肝硬化氨负荷组中有5只大鼠角膜反射与翻转反射消失,证明存在肝性脑病。肝硬化组有4只生成腹水,肝硬化氨负荷组有6只生成腹水。显微镜下观察：肝硬化组及肝硬化氨负荷组肝小叶结构破坏,纤维组织增生,有明显硬化结节形成,而正常组及正常氨负荷组未见上述改变。四组脑组织大体及镜下标本未见异常。2、血氨检测结果：与正常组及正常氨负荷组大鼠的血氨相比,肝硬化及肝硬化氨负荷组大鼠在给药前血氨水平明显升高；给药后,肝硬化氨负荷组血氨进-步升高,与其他三组相比,具有显著性差异。3、EB含量检测结果：与正常组、正常氨负荷组及肝硬化组相比,肝硬化氨负荷组大鼠脑内EB含量较其他三组大鼠显著增高,最高值达到1.9890 ug／g,具有显著差异性,P<0.05。4、脑水含量检测结果：与正常组、正常氨负荷组及肝硬化组相比,肝硬化氨负荷组大鼠脑内水含量检测结果较其它三组显著升高,最高达86%,具有显著差异性,P<0.05。5、Occludin蛋白表达情况：在免疫组化染色中,四组大鼠免疫组化染色均可见occludin蛋白表达。肝硬化、肝硬化氨负荷组大鼠较正常组、正常氨负荷组大鼠相比阳性染色弱,差异有显著性(P<0.05)；肝硬化氨负荷组大鼠与肝硬化组大鼠相比阳性染色弱,差异有显著(P<0.05)；正常组大鼠与正常氨负荷组大鼠相比阳性染色无显著性差异。在Western blot分析中,正常组(正常氨负荷组)、肝硬化组、肝硬化氨负荷组occludin蛋白的表达量依次减弱,正常组及正常氨负荷组occludin蛋白的表达量无明显差异。结论1、本实验成功制备了肝硬化动物模型,在肝硬化动物模型中存在氨代谢紊乱,给予高氨诱导后,血氨水平进一步升高,脑水含量增加,BBB通透性增加,表明血氨在肝性脑病的形成过程中起重要作用。2、TJ蛋白occludin的表达明显下降,提示occludin蛋白的低表达可能是TJ结构破坏的分子基础,在调节BBB通透性变化的过程中具有重要作用。