洋葱(Allium cepa L.)是一种百合科葱属二年生草本植物,可鲜食、可加工,营养丰富,且具有一定的药用价值,有着“蔬菜皇后”的美誉。洋葱花器官较小,很难用人工控制的方法生产杂交种,因此雄性不育系及保持系的选育对于杂交种的生产尤为重要。本研究根据已知的洋葱细胞质雄性不育候选基因orf725,开发了区分洋葱S型与N型细胞质的分子标记,在此基础上通过农杆菌介导的遗传转化方法,对洋葱细胞质雄性不育候选基因orf725的功能进行了初步分析。主要结果如下:1.开发了鉴定洋葱细胞质基因型的SCAR标记,命名为OC2175。该标记在洋葱不育系中扩增出两条带(2175bp和1053bp),而保持系中仅扩增出1053bp的条带。利用17组不同遗传背景的不育系及其相应的保持系进行验证,该SCAR标记的鉴定结果与田间表型判断结果完全吻合。2.以pET32a为基础载体,利用clontech的In-Fusion HD Cloning技术成功构建了orf725的原核表达载体pET32a-orf725。转化大肠杆菌E.coil BL21(DE3),获得了带有重组质粒的工程菌,通过IPTG诱导外源蛋白表达。结果表明orf725表达蛋白对宿主细胞的生长有明显的抑制作用,生长曲线显著低于对照。可能是因为ORF725作为COXⅠ类似物的竞争性抑制剂消耗了COXⅠ类似物的耦合位点,从而影响能量产生,导致产能不足进而影响了细胞的生长;也可能是因为orf725编码一种细胞毒素肽,对大肠杆菌具有一定的致死作用。3.根据GenBank公布的水稻恢复基因Rf1b序列,克隆获得了Rf1b恢复基因5’侧翼线粒体靶向肽序列。将Rf1b5’置于orf725之前构建了Rf1b5’-orf725嵌合基因,然后将该嵌合基因连入双元载体pTCK303的BamHⅠ和SacⅠ位点,成功的构建了靶向线粒体的orf725功能验证载体。4.利用农杆菌介导的浸花法转化拟南芥,获得了潮霉素抗性植株。经PCR检测、GUS染色、表型检测以及花粉粒的亚历山大染色,成功的获得了转基因突变体植株,其表型为花器官变小,部分花粉粒失去活性,育性降低。其原因可能为ORF725的表达竞争性的抑制了正常COX I的功能,进而影响了能量的代谢。本研究为进一步明确orf725的分子机制奠定了基础。