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猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）是一种易于发生变异和重组的RNA病毒，PRRSV感染后可造成持续性感染和免疫抑制，对养猪业危害极为严重。天然免疫反应是宿主抗病毒感染的重要方式，PRRSV能够利用其编码蛋白拮抗宿主天然免疫应答，逃避宿主免疫监测。Nsp12是PRRSV复制相关的非结构蛋白，其是否参与拮抗宿主天然免疫反应尚未解析，本研究重点围绕HP-PRRSV HuN4株Nsp12在抑制Ⅰ型IFN信号通路中的作用机理展开研究。 在实验室前期研究发现HuN4株Nsp12能够抑制IFN-Ⅰ表达的基础上，为了探究Nsp12抑制IFN-Ⅰ表达的分子途径，本研究利用双荧光素酶报告系统、荧光定量PCR等分析了HuN4株Nsp12对IFN-β转录启动活性的影响，结果显示，HuN4株Nsp12能够抑制IFN-β的转录和启动子活性，而且这种抑制作用呈明显的剂量依赖性。HP-PRRSV与经典毒株Nsp12存在4个氨基酸差异，但这些差异氨基酸均不影响Nsp12抑制IFN-β启动子的活性。将Nsp12经过系列截短后分析其抑制IFN-Ⅰ表达的主要功能域，结果显示Nsp12抑制IFN-Ⅰ表达的主要区域位于其N端结构域。为了确定Nsp12抑制IFN-β的信号通路，检测了Nsp12对RIG-Ⅰ信号通路和TLR3通路的影响，结果显示，Nsp12对RIG-Ⅰ及其接头蛋白MAVS诱导的IFN-β产生了明显的抑制作用，但对TRIF刺激的IFN-β产生没有抑制作用，表明Nsp12是通过RIG-Ⅰ信号通路抑制IFN-β表达，而非TLR3信号通路。由于IFN-β的表达可受转录因子IRF3和NF-κB的调节，检测了Nsp12对IRF3和NF-κB结合域的启动子活性，结果显示，Nsp12能够抑制转录因子NF-κB结合域的启动子活性。而且Nsp12还可以抑制由TNF-α刺激引起的p65蛋白核迁移。以上研究结果证实HP-PRRSVHuN4株Nsp12能够通过NF-κB的激活途径抑制IFN-β的表达。 为了继续探究Nsp12蛋白的功能，将前期通过酵母双杂交筛选出的与Nsp12互作的宿主细胞蛋白半乳糖凝集素3(LGALS3)，利用免疫共沉淀和激光共聚焦试验进行鉴定，结果证实Nsp12和LGALS3存在相互作用，并确定了LGALS3与Nsp12相互作用的区域位于LGALS3(125aa-166aa)。将LGALS3过表达后，可使HuN4株在Marc-145细胞中的增殖受到明显抑制，而在LGALS3缺失细胞系Marc-145ΔLGALS3中则可促进HuN4株的增殖。有趣的是，发现在Marc-145细胞中LGALS3过表达不仅能够抑制IFN-β的启动子活性，而且可以抑制RIG-Ⅰ诱导的IFN-β产生，同时还能够抑制转录因子NF-κB结合域的启动子活性。在Marc-145ΔLGALS3缺失细胞系中，由poly(I:C)刺激诱导的IFN-β启动子活性明显强于正常的Marc-145细胞;Nsp12虽然在两种细胞系中均能抑制IFN-β启动子的活性，但其在Marc-145ΔLGALS3缺失细胞系中的抑制程度明显弱于正常Marc-145细胞。上述研究表明，互作蛋白LGALS3可能在Nsp12抑制IFN-β表达的过程中发挥了协同作用，但Nsp12抑制IFN-β表达并非完全依赖于互作蛋白LGALS3。 综上所述，本研究证实了PRRSV Nsp12能够通过RIG-Ⅰ/NF-κB通路抑制IFN-Ⅰ的表达，其互作蛋白LGALS3也能够协助Nsp12通过RIG-Ⅰ/NF-κB通路发挥抑制作用，为阐明PRRSV免疫抑制机理提供了新的理论依据。