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在我国结直肠癌的发病率居所有恶性肿瘤第三位。主要死因为血性及淋巴转移,约30–40%的患者在确诊时已发生转移。常见转移部位有区域淋巴结,肝脏,肺及腹膜,其中以肝脏最为常见,因此抑制转移将成为结直肠癌的有效治疗方法。研究发现HGF/c-Met信号通路与结直肠癌肝转移密切相关。肝细胞生长因子HGF又称离散因子( scatter factor , SF),其受体为c-Met,两者结合后可激活多条下游信号通路,具有强促有丝分裂、组织器官成形、诱导上皮细胞迁移、侵袭以及诱导血管生成等作用。在一些恶性肿瘤组织中包括结直肠癌在内, c-Met基因存在突变、过表达,而且与肿瘤发生、发展、转移及患者预后有密切关系。有研究表明,合并肝转移的结直肠癌患者中c- Met拷贝数存在以下关系:肝转移灶>正常肝组织,肝转移灶>原发灶,而且HGF含量较无肝转移的患者高。因此,HGF/c-Met极有可能成为结直肠癌,尤其是合并肝转移的结直肠癌新的治疗靶点。小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)作为与RNA干扰现象紧密相连的非编码RNA之一,是后基因组时代的重要研究工具。其作用机制是:进入体内的siRNA双链解开,引导链(指siRNA反义链,antisense siRNA)进入RNA介导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC),并切断具有序列特异性的靶标mRNA,切断部位大约在与反义小干扰RNA配对序列的中部,然后靶标mRNA降解。我们在前期实验中已经证明HGF可以促进人结肠癌细胞SW620的增殖和移行,并呈质量浓度依赖性。本实验采用RNAi方法抑制HGF受体c-Met基因表达,进一步探讨HGF/c-Met信号通路对人结肠癌细胞株SW620的增殖和移行的影响,以期寻找治疗结直肠癌的新方法。目的:筛选结肠癌细胞c-Met特异性siRNA并构建其慢病毒载体;包装病毒并筛选稳定下调c-Met的SW620细胞系。方法:1设计3条针对c-Met基因的siRNA序列,将其克隆入慢病毒载体pSD31中,用Lipofectamine?2000介导,将载有c-Met基因特异性的siRNA序列的慢病毒质粒转染入人结肠癌细胞株SW620,同时设立空白对照。2用Western Blot,RT-PCR方法检测细胞中c-Met蛋白和mRNA表达改变情况。3选择沉默效率最高的序列,用Lipofectamine?2000介导,将pRSV,pMDG,pMDLg-pRRE及连有目的片段的慢病毒载体共转染293T细胞进行病毒包装,转染SW620细胞,用嘌呤霉素(puromycin)筛选稳定细胞株。4倒置显微镜下观察各组细胞的形态学变化。结果:1通过酶切及公司测序等方法验证构建慢病毒载体的正确性,成功构建慢病毒载体pSD31-met并将其转染入人结肠癌细胞株SW620中。2采用Western Blot,RT-PCR方法检测转染pSD31-met后SW620细胞中c-Met的mRNA和蛋白表达均较对照组显著降低。3用嘌呤霉素(puromycin)筛选出稳定细胞株,PCR检测携带目的片段的病毒基因整合到宿主细胞基因组中,Western Blot检测c-Met蛋白表达下降。4倒置显微镜下观察发现,在转染后48小时,转染pSD31-met组,细胞增殖明显减少,细胞数量减少,细胞聚集情况明显抑制。结论:1不同的siRNA对人结肠癌细胞c-Met基因的表达抑制效能不同。2能够构建出有干扰效能的c-Met siRNA慢病毒载体。3成功包装出慢病毒并筛选出稳定转染细胞。