论文部分内容阅读
工作目的 除原发性骨肿瘤外,骨也是很多其他肿瘤的最常见转移部位。肿瘤所导致的骨癌痛严重影响着患者的生理功能及心理状态。由于目前癌痛治疗药物仍存在耐受性及中枢神经系统(central nervous system,CNS)毒副反应,临床癌痛治疗仍面临巨大挑战。近期在动物模型中的研究发现,T细胞浸润至脊髓并促进神经病理性疼痛的发展。辅助性T细胞17(T helper type 17,Th17)是近年来新发现的一种T细胞亚型,其特异性表达促炎因子IL-17/IL-17A,且易穿过血脑屏障及血脊髓屏障进入CNS,促进中枢炎症反应的发生。调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)特异性表达叉状头转录因子3(forkhead box P3,Foxp3),其促进神经病理性疼痛内源性恢复的作用近期也被证实。Th17细胞和Treg细胞的分化受TGF-β、IL-6和IL-23的调节。而在骨癌痛中脊髓水平是否出现T细胞浸润以及Th17/Treg细胞是否参与骨癌痛的发展,目前尚无报道。作为CNS最主要的免疫细胞,小胶质细胞在骨癌痛发展中的作用逐渐被证实,并发现在神经病理性疼痛中激活的小胶质细胞发生M1/M2极化的改变。此外,有研究表明T细胞诱导的免疫反应可影响小胶质细胞的激活及极化。而脊髓小胶质细胞M1/M2极化是否影响骨癌痛,及其是否存在和T细胞的相互作用仍未知。基于以上背景,本课题研究目的如下:(1)建立骨癌痛模型,明确在骨癌痛的发生及发展过程中脊髓水平是否出现T细胞浸润;(2)探究在骨癌痛的发生及发展过程中脊髓水平Th17/Treg细胞的表达;(3)研究在骨癌痛的发生及发展过程中脊髓水平小胶质细胞M1/M2极化的改变;(4)探讨脊髓水平Th17/Treg细胞调控小胶质细胞M1/M2极化在骨癌痛中的作用。研究方法(1)本研究采用雄性C3H/HeN小鼠和NCTC 2472小鼠纤维肉瘤细胞,建立小鼠骨癌痛模型。通过测定机械缩足阈值(paw withdrawal mechanical threshold,PWMT)和自发抬足次数(number of spontaneous flinches,NSF)评估小鼠疼痛行为学;通过股骨切片HE染色观测肿瘤生长,评价骨癌痛模型是否成功建立;通过免疫荧光方法检测骨癌痛过程中脊髓中是否有T细胞表达;(2)使用免疫荧光、Western blotting、ELISA等方法检测小鼠脊髓Th17和Treg细胞的表达,以及小鼠脊髓/外周IL-17、IL-17A、IL-17Areceptor(IL-17AR)的表达和 TGF-β、IL-6 和 IL-23 的水平;(3)使用免疫荧光、Western blotting、ELISA等方法检测小鼠脊髓中M1/M2型小胶质细胞及iNOS、Arg-1的表达,以及脊髓和外周IL-1β和IL-10的水平;(4)分别鞘内注射小鼠IL-17/IL-17A中和抗体和IL-17RA/IL-17R中和抗体,观察小鼠PWMT和NSF的改变,检测T细胞和Th17/Treg的表达,以及小胶质细胞M1/M2极化的改变,并测定相应细胞因子的变化。结果(1)与正常对照组及假手术组小鼠相比,肿瘤组小鼠在造模后第14天出现明显的PWMT下降和NSF上升,患侧股骨骨髓腔内出现大量肿瘤细胞浸润和骨质破坏,伴随着脊髓内大量T细胞的浸润;(2)肿瘤组小鼠脊髓Treg细胞短暂性表达后逐渐消失,而Th17细胞表达不断增加。脊髓和外周IL-17和IL-17A水平不断升高,TGF-β、IL-6和IL-23的表达也逐渐增多;(3)IL-17AR表达于小胶质细胞上。从第14天起,IL-17AR水平显著升高,小胶质细胞M1极化逐渐增多,M2极化逐渐降低,伴随着脊髓及外周水平炎症反应的升高;(4)鞘内注射IL-17/IL-17A中和抗体后小鼠骨癌痛明显缓解,脊髓中的T细胞、小胶质细胞及M1/M2极化明显减少,脊髓及外周水平炎症反应减轻;(5)鞘内注射IL-17RA/IL-17R中和抗体后小鼠骨癌痛明显缓解,脊髓T细胞浸润无明显减少,但Treg细胞表达升高,Th17细胞减少,小胶质细胞及M1/M2极化明显降低,伴随着脊髓及外周炎症反应的减轻。结论 在骨癌痛的发生及发展过程中大量T细胞浸润至脊髓,其中Treg细胞在脊髓中出现较早且短暂性表达,而后脊髓内的Th17细胞不断增多。且IL-17及IL-17A的水平不断升高,其通过IL-17AR作用于小胶质细胞,促进了小胶质细胞M1/M2极化朝M1方向的不断增加,进一步加重了脊髓内的炎症反应,促进了骨癌痛的发生及发展。中和骨癌痛小鼠脊髓内的IL-17/IL-17A或IL-17RA/IL-17R可抑制脊髓内T细胞的浸润,或增加Treg细胞表达并抑制Th17细胞功能,进而抑制小胶质细胞激活及极化,减轻脊髓甚至全身的炎症反应,发挥缓解骨癌痛的作用。