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背景:暗色丝孢霉病(Phaeohyphomycosis,PHM)是一大组由暗色真菌引起的皮肤、皮下组织或系统性感染。PHM组织学上以出现棕褐色分隔菌丝或酵母样结构为表现特征。暗色真菌为一组孢子或菌丝的壁具有黑色素样颜色为特征的真菌,其细胞多呈淡褐色至深褐色。土壤及相关植物中常可检测到暗色真菌的存在,其广泛分布于世界各地。已报道引起暗色丝孢霉病的致病菌种超过70个属150多个种。PHM患者的免疫状态可以大体分为以下两类,一类是免疫力大致正常宿主,但近年来报道以往认为是免疫力正常的PHM患者中有一部分存在CARD9基因突变;另一类是因服用免疫抑制剂、化疗药物等引起宿主免疫力抑制,进而导致条件致病性暗色真菌感染。我们在临床诊疗中诊断了一例病史长达16年的皮下型PHM,患者为35岁女性,临床表现为面部局限性斑块。我们从患者皮损中分离培养出菌落呈暗黑色,镜检为暗色有隔菌丝,未见产孢结构,无法通过形态学特征对该菌进行种属归类鉴定。提取该菌DNA后PCR扩增内转录间隔区(Internal transcribed spacer,ITS)等保守序列测序,经比对得知其为透明球腔菌(Pallidocercospora crystallina),该菌是一种植物致病菌,可导致叶斑病。该菌在人类导致感染尚未见报道。该菌的生长特征、致病毒力及机体对其感染后的免疫反应尚不清楚,为此我们围绕透明球腔菌为何引起人类感染进行了一系列的研究。目的:为进一步阐明透明球腔菌致病性,一方面对其生长特性及形态学特点进行观察,同时运用全基因组测序技术对菌株进行测序,并构建该菌株引起的暗色丝孢霉病小鼠模型;另一方面,我们对宿主可能存在的先天免疫缺陷进行全外显子组测序,并对分析得到的可能致病突变进行蛋白表达及功能探究。方法:1.我们在临床中确诊一例由透明球腔菌感染所致的病史长达16年的皮下型暗色丝孢霉病患者,对患者进行组织病理及真菌培养,并利用ITS、18SrDNA、肌动蛋白、延伸因子等保守序列测序,并进行Blast比对,进行菌株种属归类。2.利用多种培养基观察菌株生长状况,菌落形态学特征,显微镜及电镜下观察菌株产孢结构及产孢方式。3.观察不同培养温度对透明球腔菌菌落生长的作用。4.提取真菌基因组构建Illumina标准文库,并借助Illumina HiSeq平台进行真菌全基因组测序,并借助测序结果进一步分析菌株特性。5.利用C57BL/6、BALB/c及ICR三种小鼠品系构建透明球腔菌引起的暗色丝孢霉病小鼠动物模型并对其在免疫正常宿主的致病力进行在体探究。6.利用裸鼠构建透明球腔菌引起的暗色丝孢霉病小鼠动物模型并对其在免疫缺陷宿主的致病力进行在体探究。7.利用患者及其父母进行全外显子测序,分析并找到可能的致病基因突变。8.对全外显子分析得到的可能致病突变进行蛋白表达及功能探究。结果:1.该患者为一35岁女性,自诉16年前曾被树枝刺破左侧面颊,其后皮损缓慢增大,曾在当地医院行冷冻及口服抗生素治疗后效果不佳。组织病理提示表皮假上皮瘤样增生,真皮内混合化脓性炎症,肉芽肿形成,可见多核巨细胞,在角质层、表皮微脓疡内及真皮多核巨细胞内均可见到棕褐色有隔菌丝及类酵母样细胞。组织真菌培养见一暗色菌落,利用ITS、18S rDNA、肌动蛋白、延伸因子等保守序列测序提示为透明球腔菌。2.从皮损组织中分离的真菌在SDA、PDA、OA、CMA培养基培养两周后生长良好,可见黑褐色的菌落,表面皱褶,菌落边缘有白膜,背面呈黑褐色。真菌小培养镜检可见棕褐色有隔菌丝,不产生孢子;扫描电镜见相互交联的菌丝结构,未见明显的产孢结构。3.将菌株转种至SDA及PDA培养基后置于不同温度培养2周,该菌28℃生长良好,35℃条件下只见约0.4cm直径的菌落生长,而37℃不生长。同时我们配置含有放线菌酮的SDA及PDA培养基,将菌株转种至培养基表面,置于28℃培养,观察2周未见菌株生长。4.真菌全基因组测序得到原始数据利用Trimmomatic-0.36进行剪切及过滤。使用SPAdes对二代测序数据进行基因组拼接,多Kmer值为77、91及127。采用Prokka对组装结果进行基因元件预测。组装的全基因组含36958195个碱基,共预测到15499个编码基因。基因组通过与Eukaryotic Clusters of Orthologs(KOG)数据库、KEGG数据库及病原-宿主相互作用数据库对比进一步分析分类的蛋白功能。5.透明球腔菌菌悬液注射至C57BL/6、BALB/c及ICR三种品系小鼠足垫皮下可引起小鼠足垫不同程度肿胀。但足垫肿胀均可在3-4周逐渐消退,未见小鼠出现播散性系统感染。透明球腔菌菌悬液注射至小鼠腹腔未引起C57BL/6小鼠、BALB/c小鼠及ICR小鼠死亡,四周后组织病理未见真菌存在,组织培养未见菌落生长。6.透明球腔菌菌悬液注射至裸鼠足垫皮下可引起裸鼠足垫肿胀,其肿胀程度较免疫力正常小鼠轻,足垫肿胀均可在3周左右恢复正常,未见裸鼠出现播散性系统感染。透明球腔菌菌悬液注射至裸鼠腹腔未引起裸鼠死亡。7.患者及其父母的全外显子测序发现CARD9(c.1118 G>C or p.R373P)纯合错义突变,可能致使患者抗真菌免疫存在先天缺陷,进而导致透明球腔菌的感染相关。8.患者携带的CARD9突变不影响其mRNA及蛋白表达,但携带该纯合错义突变CARD9的中性粒细胞相较于携带杂合位点或野生位点的中性粒细胞,其体外对透明球腔菌的杀伤能力显著降低。结论:通过本课题研究,我们证实透明球腔菌可以引起人类暗色丝孢霉病。我们对该菌株的形态学和生长特征进行探讨,发现该菌在多种培养条件下均不产胞,无法通过形态学进行鉴定。人体核心体温对该菌株的生长具有一定的抑制作用,这可以部分解释患者透明球腔菌感染为何长期局限而不播散。通过对该菌株进行全基因组测序并对基因功能进行注释,结果提示透明球腔菌致病力相对较低。利用注射透明球腔菌构建的暗色丝孢霉病小鼠模型提示该菌不能在免疫正常小鼠及适应性免疫缺陷小鼠引起播散性感染。值得关注的是,通过对患者及其父母的全外显子测序,我们发现患者携带CARD9全新纯合错义突变(c.1118G>C,R373P),该突变可能是其罹患暗色真菌感染的原因之一。我们进一步发现该位点的纯合或杂合突变并不影响CARD9的mRNA或蛋白水平表达。有意思的是,相较于携带杂合或者野生位点的中性粒细胞,携带纯合突变的中性粒细胞表现为显著降低的杀伤透明球腔菌的能力,这提示该纯合突变可能致使CARD9蛋白功能缺陷,导致宿主中性粒细胞杀伤透明球腔菌存在障碍,进而导致宿主出现透明球腔菌感染。我们的研究提示该菌具有一定的致病力,但不足以引起免疫力正常宿主的持续感染,而CARD9突变可能致使患者出现罕见暗色真菌感染,临床医师在遇到难以解释的暗色真菌感染时应警惕潜在的CARD9突变可能。