【摘 要】
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生长素抑制蛋白基因(Auxin repressed protein gene,ARP)受到生长素(IAA)信号抑制表达,在植物的生长、发育、抗病、抗逆以及种子休眠等过程中发挥重要的作用。但有关水稻生长素抑制基因OsARP1的研究,目前还没见报道。本文采用基因过表达和CRISPR/Cas9基因敲除转基因技术,创建水稻OsARP1基因过表达及其启动子和外显子敲除转基因植株,研究这些转基因植株在种子萌发
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生长素抑制蛋白基因(Auxin repressed protein gene,ARP)受到生长素(IAA)信号抑制表达,在植物的生长、发育、抗病、抗逆以及种子休眠等过程中发挥重要的作用。但有关水稻生长素抑制基因OsARP1的研究,目前还没见报道。本文采用基因过表达和CRISPR/Cas9基因敲除转基因技术,创建水稻OsARP1基因过表达及其启动子和外显子敲除转基因植株,研究这些转基因植株在种子萌发和幼苗生长等方面的差异,获得了如下结果:1、获得了OsARP1过量表达载体转化再生植株191株,对其中60株进行阳性检测发现了转基因阳性植株56株,阳性率为93.33%。采用qRT-PCR方法对56株T0代转基因阳性植株OsARP1基因的表达量进行分析,发现表达量高于野生型2倍以上的有27株,占阳性植株总数的48%。2、获得了OsARP1启动子敲除载体转化再生植株112株,对其中47株进行阳性检测发现了转基因阳性植株44株,阳性率为93.62%。对44株阳性植株靶点序列进行分析,发现31株靶点序列发生了变异,变异率为70.45%;在靶点1发生变异的植株28株,纯合变异13株;在靶点2发生变异的植株27株,纯合变异8株;在两个靶位点都发生变异的24株,纯合变异8株。共发现85个变异位点,平均每株变异植株具有2.74个变异位点。在总共85个变异位点中,碱基替换30个,其中单碱基替换26个;碱基缺失36个,其中单碱基缺失14个,5个及5个以上多碱基缺失11个;碱基插入19个,其中单碱基插入14个,5个及5个以上多碱基插入2个;杂合变异位点62个,纯合变异位点23个,纯合变异位点占总变异位点的27.06%。qRT-PCR分析了3种启动子敲除纯合变异株OsARP1基因表达量,发现OsARP1启动子序列变异明显地降低该基因表达。3、获得了OsARP1外显子敲除载体转化再生植株215株,对其中50株进行阳性检测发现了转基因阳性植株47株,阳性率为94.00%。对47株转基因阳性植株靶点序列进行分析,发现33株靶点序列发生了变异,变异率为70.21%。在靶点1发生变异的植株28株,纯合变异10株;在靶点2发生变异的30株,纯合变异的8株;在两个靶位点都发生变异的28株,纯合变异6株。共发现71个变异位点,平均每株变异植株具有2.15个变异位点。在总共71个变异位点中,碱基替换15个,其中单碱基替换8个;碱基缺失41个,其中单碱基缺失3个,5个及5个以上的多碱基缺失33个;碱基插入15个,其中单碱基插入7个,5个及5个以上的碱基插入2个;杂合变异位点55个,纯合变异位点16个,纯合变异率为22.53%。4、从T0代启动子敲除和外显子敲除变异植株中各选取3株纯合变异植株繁殖T1代,成功测定了31株启动子敲除和36株外显子敲除T1代植株的靶点序列,分别发现29株和35株与T0代植株变异完全一致,只有3株T1代植株发生了新的变异。95.52%的T1代植株变异与T0代变异类型完全相同。5、测定了上述3种启动子敲除和3种外显子敲除纯合变异植株的种子萌发率和幼苗株高,发现OsARP1启动子和外显子敲除植株的萌发率和幼苗株高均明显低于野生型,表明水稻OsARP1基因表达下调或功能缺失都有可能明显地影响水稻生长发育。上述研究结果为进一步研究水稻生长素抑制蛋白基因对水稻生长发育以及抗逆、抗病中的作用提供了良好的研究材料。
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