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菜心(Brassica campestris L.ssp.chinesis var.utilis Tsen et Lee),又称菜薹,是一、二年生草本植物,属于十字花科(Brassicaceae)白菜亚种中的1个变种,当前在我国华南区域种植面积最广,全国各地都有种植。菜心的主要产品器官是菜薹,因此菜心的产量和品质与菜薹的发育有关。生产及研究中发现异常低温会提前菜心抽薹开花,从而影响菜心的产量和品质。然而对于异常温度影响菜心的抽薹机制仍不明晰,这限制了菜心的推广及高产技术的开发。WRKY家族是目前植物特有的1类转录因子,是当前发现最大的转录因子家族之一,其在植物抗逆性、开花、茎发育等重要过程均起到重要的调控作用。因此,本试验选用菜心早熟品种“油绿501”为材料,调查低温处理下菜心的生物学性状,并采用荧光定量PCR筛选响应低温的菜心WRKY基因,在此基础上采用分子生物学方法,如基因克隆、生物信息学分析、表达特性分析及功能验证等,分析WRKY转录因子在低温诱导菜心提早抽薹开花过程中的调控作用,为进一步阐明菜心抽薹机制奠定基础,也为菜心生产技术提供理论指导。主要结果如下:1.对菜心进行不同时间的15℃低温处理,处理时间分别为0 h、24 h、48 h,结果表明15℃低温处理能使菜心提前抽薹,使菜心的株高增加、并降低茎粗,同时低温处理使现蕾和开花时间均提前。随着低温处理时间的延长,低温对菜心抽薹开花的影响更明显。此外,低温处理可以使叶片和茎中基因BcSOC1-1和BcSOC1-2的表达量在不同处理时期表达量上调。2.利用荧光定量PCR筛选菜心中与低温逆境有关的WRKY基因,结果表明低温处理后叶片中有9个WRKY基因在不同时期表达量上调,茎中有7个WRKY基因在不同时期表达量上调,其中基因BcWRKY22和BcWRKY70在叶片和茎中的表达量均上调。3.利用RT-PCR法克隆得到菜心BcWRKY22、BcWRKY70基因,其基因ORF全长分别为897 bp、852 bp,菜心BcWRKY22与白菜的BrWRKY22相似性达到98%,菜心BcWRKY70与白菜的BrWRKY70相似性达到100%。系统进化树分析表明BcWRKY22、BcWRKY70与十字花科的同源性较高。氨基酸序列及蛋白质结构分析表明BcWRKY22和BcWRKY70均含有WRKY转录因子家族典型的WRKY结构域。4.在拟南芥中异源表达菜心BcWRKY22基因,与野生型WT相比,转基因拟南芥可以提前抽薹,同时转基因植株茎和叶片中AtSVP和AtFLC的表达量显著低于野生型WT,而AtSOC1的表达量显著高于野生型,而且,低温处理过的转基因拟南芥茎和叶片中AtSVP和AtFLC的表达量更低,而AtSOC1的表达量更高。5.在酵母单杂交实验中,将pGADT7-WRKY22表达载体转入pABAi-SOC1诱饵载体酵母菌中,在含有合适AbA抑制浓度的SD/Leu缺陷培养基上能长出酵母菌,表明WRKY转录因子可以结合开花相关基因SOC1的启动子,说明WRKY转录因子对开花相关基因SOC1可能具有调控作用。综上所述,BcWRKY转录因子参与了低温(15℃)对菜心抽薹开花的调控,低温可能通过上调BcWRKY22基因表达量,进而上调菜心开花相关基因BcSOC1的表达,提前菜心抽薹开花。