【摘 要】
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目的:研究在氧气和葡萄糖被剥夺的情况下,体外培养的皮层神经元中自噬/溶酶体的变化及在神经细胞损伤中的作用。方法:采用OGD(oxygen glucose deprivation)法建立小鼠皮层神
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目的:研究在氧气和葡萄糖被剥夺的情况下,体外培养的皮层神经元中自噬/溶酶体的变化及在神经细胞损伤中的作用。方法:采用OGD(oxygen glucose deprivation)法建立小鼠皮层神经元体外缺血模型,用免疫细胞化学法检测模型神经元的损伤,MTT法检测神经元的存活率;MDC观察OGD处理对神经元自噬活性的影响;Western Blot和免疫细胞化学法检测自噬溶酶体途径相关蛋白LC3、Beclin-1、Lamp-2蛋白的表达;给予自噬抑制剂3-methyladenine (3-MA,10 mM),通过LDH漏出率检测3-MA对缺氧引起的神经元损伤的影响。Western Blot检测3-MA对模型中神经元自噬相关蛋白LC3、Dram、Beclin-1、Lamp-2和凋亡相关蛋白p53、PUMA、Bcl-2、DRAM蛋白的表达影响。结果:我们利用OGD法成功建立了小鼠皮层神经元体外缺血模型。免疫细胞化学和MTT结果证实了糖氧剥夺(OGD)处理对于神经元的损伤是剧烈的,并且呈现一定的时间相关性。Western Blot和免疫细胞化学结果显示,LC3和Beclin-1在短暂OGD处理后表达降低但随后立即上升,在1 h达到峰值(P<0.05),2 h又开始下降(P<0.05)。同时分子伴侣自噬的标记物LAMP-2的表达也是由弱到强,同样在1 h达到峰值(P<0.05),2 h表达仍较高。在加入3-MA后,缺氧时间短的神经元(1 h以内),其损伤相较于单纯缺氧进一步加剧(P<0.05),提示自噬的保护作用在于OGD的早期,与自噬的高活性相关。利用Western Blot法我们检测了凋亡相关蛋白p53、PUMA和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,发现随OGD时间的延长,p53和PUMA的表达均显著增加(P<0.05),而Bcl-2的表达则逐渐下降(P<0.05)。DRAM蛋白的表达在OGD 2 h达到最高(P<0.05),提示自噬途径在神经元OGD模型中的作用已经发生改变,凋亡成为细胞内主要的反应。结论:1.糖氧剥夺对小鼠原代皮层神经元产生了致死性的损伤。2.此损伤过程伴随了自噬的发生,并且在短期内自噬活性达到峰值随后下降。3.自噬在神经元的OGD处理的早期起到了保护作用,晚期的作用被凋亡作掩盖。4.凋亡在OGD处理晚期被启动,可能是神经细胞在OGD条件下死亡的主要机制。
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