目的 树突状细胞(dendritic cells，DC)是人体内重要的抗原递呈细胞，其可以把肿瘤抗原特异性地递呈给免疫效应细胞而产生肿瘤特异性免疫反应。它有很强的摄取、处理、递呈抗原的能力以及高表达共刺激分子，自90年代以来已成为免疫治疗研究热点之一。本研究系统地探讨乳腺癌患者外周血中免疫细胞如T、B淋巴细胞、NK细胞等的变化，以及乳腺癌细胞表面分子的改变，进一步明确乳腺癌患者的免疫状况。希望乳腺癌抗原负载后的DC能够弥补乳腺癌患者的免疫缺陷，并探讨肿瘤抗原负载的DC免疫过继治疗乳腺癌动物模型的效果。 材料和方法 1、乳腺癌患者的免疫功能检测：随机抽选2001年3月至10月30例乳腺癌患者的外周血，采用流式细胞技术分析淋巴细胞表面CD3、CD4、CD8、CDl9、CD28的表达，单核细胞表面CD40、CD80、CD86的表达。 2、乳腺癌细胞表面分子的表达：采用流式细胞技术检测5株乳腺癌细月包MCF-7、SK-BR-3、T47D、MDA-MB-435s、ZR-75-30表面MHCⅡ类抗原与共刺激分子CD40、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)的表达，并与正常乳腺细胞HBL-100作比较。同时检 1汕k厂村人学博【：学位论义 渺J35仲憎L腺癌肿瘤标本这些分子的表达，并与乳腺良性病变标本 作比较。 3、人外周血中树突状细胞分离、培养与鉴定：采集健康成人外 周血 20人份，乳腺癌患者外周血 30人份，每份 10毫升，肝素 抗凝。用淋巴细胞分离液分离外周血，收集单个核细胞，调节细 J包浓度为 IO‘／ml，然后在 6 JL板上占壁，每JLh。Zml，2，J、时后 吸去悬浮细胞，加入新鲜营养液。每隔1天半量换液一次。用共 聚焦显微镜拍摄所培养的细胞，流式细胞枝术鉴定所培养的细 胞。 4、B：lb儿，J、鼠骨髓DC的培养：元菌操作取，J、鼠后肢股骨，用 注射针将髓腔中的骨髓细胞吹打出，用0．8％TriSNH人溶去红 细月后，PBS洗2次，用含mGM－CSF（．3ng／ml），lL＊20ng／ml） 和 10o，J、牛血清的 yMI 640 Z全培养基重悬至 l．0 xlo‘／ml， 铺于 6孔板上，ZmNL，第 3天轻轻晃动培养板，吸弃全部上清 （去除粒细胞），及时补入含细胞因子浓度相同的完全培养基， 第 6天轻轻吹吸下疏松粘附于培养板底的聚集体，置于新的培养 板中，并加入等量的上述完全培养基，继续培养24小时，用于 免疫标记鉴定、分泌细胞因子检测及生物学活性的研究。 5、B：lb七，J、鼠乳腺癌模型的建立：选择对数生长期的 TM40D， 用 0．25％胰 蛋白酶消 化，PBS洗涤2次；细胞浓度调至 10‘．10‘／ml。 在 Balb七小鼠胸壁第 56肋间或腹壁第 4对乳腺处皮下接种肿瘤 go胞0．1m1，相当于10’1～胞／X小鼠。每天观察肿瘤的生长情 况，用游标卡尺测量肿块的大小。 6、肿瘤抗原负载的DC免疫过继治疗B：lb止。J、鼠乳腺癌模型： 动物分为 3组，每组 10 ．q小鼠，皆于腹壁右侧第 4对乳腺处皮 下接种对数生长期的 TM40D细胞，IX 10‘／只，在肿瘤细胞接种 7 内水厂村人学博卜学位沦义后第 3天，于同侧腹股沟皮下接种 TM40D负载的 DC（2 XIO‘／只／次），以后分别于第10，门，24天每组动物接受与第一次同样的治疗。观察肿瘤的生长、动物存活率以及肿瘤的转移情况。 结 果l、乳腺癌患者外周血中 CD3、CD4、CDS、CD16、CD19阳性的淋巴细胞与对照组相比无显著性差异…功刀5八但是CD28阳性 T i田胞少于对照组（p＜0．05），特别是CD4／CD28双阳性 T兰胞明显少于对ig组（p功．005）。手术后7天左右CD28阳性T细胞就恢复到正常，与对照组相比无显著性差异（p＞0刀5），说明乳腺癌患者免疫细胞减少与肿瘤负荷有关。乳腺癌患者单核细胞、表达共刺激分子 CD80（p＜0．05）、CD86（p＜0．00L CD40表达与对照组相比无显著性差异巾叩刀5）。2、5株乳腺癌细胞MHC H类分子表达都与HB卜mo有显著性差异（p＜0．05），MCF－7 i田胞表达水平最低，约为 HBL－100勺 1／5。MDA－MB－4355与 ZR刁5S0细包表达水平是HBLl 的 2倍，MDA．MB．4355荧光强度也比HBLl0O及其它乳腺癌细胞高。但MDA－MB－4355 i田包表＠CD40分子表达水平最低，约为 MCF－7与HBL－mo CD4O分子表达水平的m％。MDA－MB．4355细月CD80、CD86分子表达水平与 HBL－100才当（p＞0．05），另 4株乳腺癌细月 CD80、CD86分子表达者比 HBL－100｛（p＜0．05）。乳腺癌原代细胞 CD40表达水平与对照组相比无显著性差异 （p＞0刀5），＊＊0、＊＊6白