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第一部分长链非编码RNA和mRNA在人动脉粥样硬化组织中的表达谱分析及长链非编码RNA430945在冠心病急性心肌梗死患者血液中的表达研究
目的:为探讨动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的发病机制及寻找新的治疗分子靶点,本实验应用微阵列芯片技术检测AS和正常对照组织中长链非编码RNA(long noncoding RNA,LncRNA)和mRNA表达谱的变化,联合分析并确定相关lncRNA和mRNA在人AS组织与正常血管组织中的表达是否存在差异.为明确血浆中的lncRNAs是否可作为急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)的生物学标志物,对AMI患者与稳定型心绞痛(stable angina pectoris,SAP)患者血液中lncRNA的表达水平进行比较.
方法:收集2017年01月~2017年11月在唐山市工人医院手术室切除获取的6例人AS主动脉组织标本,所有病例均经病理科诊断证实,术前病人未进行规范药物和其他针对AS的治疗.另从器官供体获得新鲜人正常动脉壁组织标本作为对照(n=6),应用基因芯片技术完成lncRNA和mRNA表达谱的联合筛查.采用实时定量PCR(qRT-PCR)对表达谱芯片结果进行验证;Westernblot检测人血管组织中相关蛋白表达变化;通过免疫荧光染色共定位技术确定相关蛋白的表达变化主要源自血管平滑肌细胞(vascularsmooth muscle cells,VSMCs).
LncRNA和mRNA的芯片检测要求信号均匀,清晰,总RNA质量合格,无干扰.芯片结果数据标准化后,以2倍差异为筛选基准,分析表达差异的lncRNAs和mRNAs.进一步对mRNA表达谱进行基因本体论(geneontology, GO)分析及KEGG通路分析,并对差异表达的lncRNAs和mRNAs进行联合分析.qRT-PCR实验数据采用2-△△Ct法进行分析.
选取来自2017年12月至2018年05月期间相继在唐山工人医院心血管内科住院的患者80例,其中AMI患者37例,SAP患者43例.测定AMI患者及SAP患者血液中相关lncRNA的表达水平,并比较两组结果以探究相关lncRNA在AMI早期诊断中作为标记物的可能性.
结果:
1.LncRNA和mRNA表达谱芯片分析结果显示,人AS组织与正常动脉组织相比,lncRNA和mRNA的表达谱均存在显著性差异(>2倍,P<0.05).与人正常动脉组织相比,AS组织中发现显著表达差异的lncRNAs有567个(上调的有292个,下调的有275个,P<0.05),mRNAs共有871个(上调432个,下调439个,P<0.05).
2.GO分析结果显示:432个上调的mRNAs中,在生物过程中占比例最大的功能基因簇为negativeregulationoftransporteractivity(负性调控转运蛋白活性),在细胞组分当中占比例最大的功能基因簇为myofibril(肌原纤维),而在分子功能中占比例最大的功能基因簇为oxygentransporteractivity(氧转运体活性);439个下调的mRNAs当中,生物过程中占比例最大的功能基因簇为responsetostimulus(应对刺激),细胞组分中占比例最大的为plasmamembranepart(质膜部分),分子功能中占比例最大的为proteinbinding(蛋白结合).
3.KEGG通路分析显示上调信号通路有19条,最明显的为"VEGFsignalingpathway-Homosapiens(human)";下调信号通路有12条,最明显的为"Apoptosissignalingpathway-Homosapiens(human)".
4.QRT-PCR和Westernblot检测结果证实,在人AS组织及正常动脉组织中表达差异明显的6个lncRNAs分别为ENST00000452578、ENST00000430945、NR_004428、uc003zqt.3、ENST00000552685和ENST00000561007,且qRT-PCR结果分析与芯片结果相一致.lncRNA和mRNA的表达谱联合分析发现,lncRNAENST00000430945(lncRNA 430945)与酪氨酸激酶ROR2存在正相关性.与此同时,qRT-PCR和Westernblot结果显示,与对照相比,人AS组织中转录水平和翻译水平的ROR2表达均有所增加.说明基因芯片筛查选取的结果是可靠的.进一步荧光染色共定位分析证实AS组织VSMCs中的ROR2表达升高.
5.在收集80例血液样本中,qRT-PCR检测结果显示,与SAP组患者相比,在AMI组患者血液中lncRNA430945的表达水平无明显差异(P>0.05).
小结:人AS血管组织中VSMCs数目明显增多,且lncRNA的表达变化与AS有关.经qRT-PCR、Westernblot和免疫荧光染色检测证实在AS组织中lncRNA430945和ROR2的表达升高且ROR2表达升高主要发生在VSMCs中.lncRNA430945是否可以作为临床AMI早期诊断的生物学标记物还需进一步研究.
第二部分LncRNA430945对AngII诱导VSMCs增殖和迁移的影响
目的:探讨lncRNA430945表达变化对VSMCs功能的相关影响.
方法:我们成功构建了在小鼠VSMCs中有效表达lncRNA430945的真核基因表达载体pcDNA-lncRNA430945;通过脂质体法将构建好的pcDNA-lncRNA430945转染到小鼠VSMCs中(转染pcDNA空白质粒设为对照)24小时后,提取总RNA,经过qRT-PCR来验证lncRNA430945的相对表达情况.对转染pcDNA-lncRNA430945和pcDNA空白质粒的VSMCs行CCK8实验检测细胞增殖能力的变化,行划痕试验和Transwell迁移实验观察转染后VSMCs迁移能力的改变.同时我们利用血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)处理VSMCs12h使之处于相应的病理状态,设计并合成靶向沉默lncRNA430945的小干扰RNA(si-lncRNA 430945)和阴性对照(si-NC)转染VSMCs,并分组如下:分别建立阴性转染组(si-NC)、lncRNA430945干扰组(si-lncRNA 430945)、AngⅡ处理组(AngⅡ)和AngⅡ处理+lncRNA430945干扰组(AngⅡ+si-lncRNA430945).用CCK8实验来检测在0、12h、24h、36h、48h5个时间点处理后细胞的增殖情况,并绘制出生长曲线.对上述四组行划痕试验和Transwell迁移实验观察抑制lncRNA430945后AngⅡ诱导的VSMCs迁移能力的改变.最后,我们在VSMCs中转染pcDNA-lncRNA430945重组质粒过表达lncRNA430945,以及在VSMCs中转染特异性si-lncRNA430945敲低lncRNA430945的表达,分别行westernblot实验来观察当lncRNA430945表达变化后ROR2的表达情况.
结果:
1.过表达lncRNA430945促进VSMCs的增殖和迁移能力
行CCK8细胞增殖实验结果显示,相对于阴性对照组,细胞在转染pcDNA-lncRNA430945后,过表达lncRNA430945后VSMCs数量明显增加且呈现时间依赖性(24hP<0.05,36hP<0.01).说明lncRNA430945有促进VSMCs增殖的作用.划痕实验结果表明,与pcDNA组比较,pcDNA-lncRNA430945组划痕后24h的VSMCs迁移数显著增加(P<0.05).Transwell迁移实验结果显示:每个视野pcDNA-lncRNA430945组VSMCs穿过ECM胶的细胞数与pcDNA组比较明显增加(P<0.05).划痕实验和Transwell迁移实验结果说明转染pcDNA-lncRNA430945后的VSMCs迁移能力明显增强.
2.敲低lncRNA430945抑制AngII诱导的VSMCs的增殖和迁移
CCK8细胞增殖实验结果显示:与si-NC组相比,AngⅡ处理VSMCs后能够明显促进细胞的增殖(36hP<0.05,48hP<0.001);尽管si-lncRNA430945组VSMCs的增殖能力与si-NC组比较未见明显变化(P>0.05),但是在AngⅡ+si-lncRNA430945组中的实验结果发现,与si-NC组相比在36h内VSMCs的增殖能力无明显差异(P>0.05),而与AngⅡ组相比,VSMCs的增殖能力则明显减弱.这些结果表明敲低lncRNA430945在生理状态下对VSMCs增殖能力无明显影响,但是在病理性AngⅡ处理情况下,抑制lncRNA430945的表达能够显著抑制VSMCs的增殖活性.
划痕实验结果显示:敲低lncRNA430945后VSMCs迁移数明显低于si-NC组(P<0.05),AngⅡ处理后VSMCs迁移数明显增加(P<0.01),而在AngⅡ+si-lncRNA430945组中的VSMCs迁移数与si-NC组相比却无明显差异(P>0.05).Transwell迁移实验结果同样表明:敲低lncRNA430945后VSMCs穿过ECM胶的数量明显低于si-NC组(P<0.05),AngⅡ处理后的VSMCs穿过ECM胶的数量与si-NC组比较显著增多(P<0.01);而AngⅡ+si-lncRNA430945组中的VSMCs相对迁移数与si-NC组未见明显差别(P>0.05).划痕实验和Transwell迁移实验结果均说明在病理性AngⅡ处理情况下,抑制lncRNA430945的表达能够显著抑制VSMCs的迁移活性.
3.在VSMCs中lncRNA430945影响ROR2的表达
我们通过转染细胞pcDNA-lncRNA430945重组质粒来过表达lncRNA430945,westernblot实验证实过表达lncRNA430945后ROR2表达明显增加.随后进行小干扰RNA(si-lncRNA 430945)转染VSMCs,行westernblot实验证实敲低lncRNA430945后ROR2表达明显降低.这些结果表明,在VSMCs中lncRNA430945的表达变化可以影响ROR2的表达.
小结:LncRNA430945参与了VSMCs的增殖及迁移过程,同时lncRNA430945的表达变化可以影响ROR2的表达.
第三部分LncRNA430945对VSMCs增殖和迁移功能影响的相关机制研究
目的:探讨lncRNA430945及关联基因ROR2对VSMCs影响的相关机制,以便更好地认识AS的发生发展机制,并为其寻找有效的分子治疗靶点和预防策略提供新的实验证据.我们采用小鼠颈动脉结扎诱导内膜增厚增殖模型,进一步验证抑制lncRNA430945的表达对血管重构的保护作用,以期为确定lncRNA430945做为AS治疗的有效分子靶点提供实验依据.
方法:利用westernblot实验检测过表达或敲低lncRNA430945后RhoA信号GTP-RhoA的变化,以及增殖、迁移相关蛋白PCNA和MMP9的表达情况.
设计并合成靶向沉默小鼠ROR2(si-ROR2)的小干扰RNA和Negativecontrol(si-NC)转染VSMCs,行CCK8细胞增殖实验检测ROR2变化对VSMCs增殖情况的影响;我们进一步在VSMCs中过表达lncRNA430945和敲低ROR2的表达,实验分组如下:第一组转染pcDNA空白质粒(pcDNA);第二组转染pcDNA-lncRNA430945重组质粒(pcDNA-lnc RNA 430945)和第三组共转染过表达lncRNA430945质粒和特异性si-RNA(pcDNA-lncRNA430945+si-ROR2).相应对上述三组行CCK8细胞增殖实验检测细胞增殖能力的变化,行划痕试验、Transwell迁移实验观察各组VSMCs迁移能力的变化.
构建小鼠颈动脉结扎诱导内膜增厚增殖模型,采用F127胶和si-lncRNA430945原位敲低lncRNA430945表达后取材,行苏木精-伊红染色,与对照组相比观察血管内膜增生情况.行Westernblot实验检测组织中相关蛋白的表达情况.
结果:
1.在VSMCs中敲低或过表达lncRNA430945后,与si-NC或pcDNA组相比较,RhoA信号GTP-RhoA以及下游增殖、迁移相关蛋白PCNA、MMP9的表达明显降低或增加(P<0.05).
2.在小鼠VSMCs中特异性敲低ROR2或过表达lncRNA430945同时敲低ROR2表达后,CCK8检测结果显示,与si-NC转染的VSMCs组相比,si-ROR2转染后细胞增殖能力受到明显抑制(36hP<0.05,48hP<0.01);同样地,敲低ROR2后能够明显抑制过表达lncRNA430945对VSMCs增殖的促进作用.
划痕实验结果表明,与pcDNA组相比pcDNA-lncRNA430945组VSMCs迁移细胞数明显增加(P<0.01);而在pcDNA-lncRNA430945+si-ROR2组中VSMCs的迁移数目与pcDNA组相比无明显差异(P>0.05).与此相应的Transwell迁移实验结果显示,与pcDNA组相比pcDNA-lncRNA430945组每个视野VSMCs迁移数明显增加(P<0.01),而pcDNA-lncRNA430945+si-ROR2组与pcDNA组相比每个视野VSMCs迁移数无明显差异(P>0.05).划痕实验和Transwell迁移实验结果提示,敲低ROR2后能够明显抑制过表达lncRNA430945对VSMCs迁移的促进作用.
3.我们采用小鼠颈动脉结扎诱导内膜增厚增殖模型,给予原位敲低lncRNA430945后行HE染色结果显示,与si-NC处理组相比,si-lncRNA430945能有效抑制血管内膜增生.(P<0.05).
4.我们通过体内实验转染si-lncRNA430945来过敲低lncRNA430945,行westernblot实验提示RhoA信号GTP-RhoA以及下游增殖、迁移相关蛋白PCNA、MMP9的表达明显降低,表明GTP-RhoA、PCNA、MMP9的表达与lncRNA430945相关.
小结:LncRNA430945通过调节ROR2、RhoA信号通路中GTP-RhoA和PCNA、MMP9等相关蛋白的表达来进一步参与了VSMCs的增殖和迁移,沉默ROR2基因有望抑制lncRNA430945对VSMCs增殖和迁移的促进作用,对lncRNA430945、ROR2及RhoA信号通路的干预有望应用于AS的靶向治疗.
结论:
1.在人AS组织中VSMCs数目明显增多.在AS组织中有大量lncRNAs转录本产生并在AS病理中发挥重要作用.其是否可以作为临床AMI早期诊断的生物学标记物还需进一步研究.
2.LncRNA430945具有促进VSMCs增殖和迁移的生物学功能.
3.LncRNA430945是通过上调ROR2、RhoA信号GTP-RhoA以及下游增殖、迁移相关蛋白PCNA、MMP9的表达,促进VSMCs的增殖和迁移.对lncRNA430945、ROR2的干预有望应用于AS的靶向治疗.
目的:为探讨动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的发病机制及寻找新的治疗分子靶点,本实验应用微阵列芯片技术检测AS和正常对照组织中长链非编码RNA(long noncoding RNA,LncRNA)和mRNA表达谱的变化,联合分析并确定相关lncRNA和mRNA在人AS组织与正常血管组织中的表达是否存在差异.为明确血浆中的lncRNAs是否可作为急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)的生物学标志物,对AMI患者与稳定型心绞痛(stable angina pectoris,SAP)患者血液中lncRNA的表达水平进行比较.
方法:收集2017年01月~2017年11月在唐山市工人医院手术室切除获取的6例人AS主动脉组织标本,所有病例均经病理科诊断证实,术前病人未进行规范药物和其他针对AS的治疗.另从器官供体获得新鲜人正常动脉壁组织标本作为对照(n=6),应用基因芯片技术完成lncRNA和mRNA表达谱的联合筛查.采用实时定量PCR(qRT-PCR)对表达谱芯片结果进行验证;Westernblot检测人血管组织中相关蛋白表达变化;通过免疫荧光染色共定位技术确定相关蛋白的表达变化主要源自血管平滑肌细胞(vascularsmooth muscle cells,VSMCs).
LncRNA和mRNA的芯片检测要求信号均匀,清晰,总RNA质量合格,无干扰.芯片结果数据标准化后,以2倍差异为筛选基准,分析表达差异的lncRNAs和mRNAs.进一步对mRNA表达谱进行基因本体论(geneontology, GO)分析及KEGG通路分析,并对差异表达的lncRNAs和mRNAs进行联合分析.qRT-PCR实验数据采用2-△△Ct法进行分析.
选取来自2017年12月至2018年05月期间相继在唐山工人医院心血管内科住院的患者80例,其中AMI患者37例,SAP患者43例.测定AMI患者及SAP患者血液中相关lncRNA的表达水平,并比较两组结果以探究相关lncRNA在AMI早期诊断中作为标记物的可能性.
结果:
1.LncRNA和mRNA表达谱芯片分析结果显示,人AS组织与正常动脉组织相比,lncRNA和mRNA的表达谱均存在显著性差异(>2倍,P<0.05).与人正常动脉组织相比,AS组织中发现显著表达差异的lncRNAs有567个(上调的有292个,下调的有275个,P<0.05),mRNAs共有871个(上调432个,下调439个,P<0.05).
2.GO分析结果显示:432个上调的mRNAs中,在生物过程中占比例最大的功能基因簇为negativeregulationoftransporteractivity(负性调控转运蛋白活性),在细胞组分当中占比例最大的功能基因簇为myofibril(肌原纤维),而在分子功能中占比例最大的功能基因簇为oxygentransporteractivity(氧转运体活性);439个下调的mRNAs当中,生物过程中占比例最大的功能基因簇为responsetostimulus(应对刺激),细胞组分中占比例最大的为plasmamembranepart(质膜部分),分子功能中占比例最大的为proteinbinding(蛋白结合).
3.KEGG通路分析显示上调信号通路有19条,最明显的为"VEGFsignalingpathway-Homosapiens(human)";下调信号通路有12条,最明显的为"Apoptosissignalingpathway-Homosapiens(human)".
4.QRT-PCR和Westernblot检测结果证实,在人AS组织及正常动脉组织中表达差异明显的6个lncRNAs分别为ENST00000452578、ENST00000430945、NR_004428、uc003zqt.3、ENST00000552685和ENST00000561007,且qRT-PCR结果分析与芯片结果相一致.lncRNA和mRNA的表达谱联合分析发现,lncRNAENST00000430945(lncRNA 430945)与酪氨酸激酶ROR2存在正相关性.与此同时,qRT-PCR和Westernblot结果显示,与对照相比,人AS组织中转录水平和翻译水平的ROR2表达均有所增加.说明基因芯片筛查选取的结果是可靠的.进一步荧光染色共定位分析证实AS组织VSMCs中的ROR2表达升高.
5.在收集80例血液样本中,qRT-PCR检测结果显示,与SAP组患者相比,在AMI组患者血液中lncRNA430945的表达水平无明显差异(P>0.05).
小结:人AS血管组织中VSMCs数目明显增多,且lncRNA的表达变化与AS有关.经qRT-PCR、Westernblot和免疫荧光染色检测证实在AS组织中lncRNA430945和ROR2的表达升高且ROR2表达升高主要发生在VSMCs中.lncRNA430945是否可以作为临床AMI早期诊断的生物学标记物还需进一步研究.
第二部分LncRNA430945对AngII诱导VSMCs增殖和迁移的影响
目的:探讨lncRNA430945表达变化对VSMCs功能的相关影响.
方法:我们成功构建了在小鼠VSMCs中有效表达lncRNA430945的真核基因表达载体pcDNA-lncRNA430945;通过脂质体法将构建好的pcDNA-lncRNA430945转染到小鼠VSMCs中(转染pcDNA空白质粒设为对照)24小时后,提取总RNA,经过qRT-PCR来验证lncRNA430945的相对表达情况.对转染pcDNA-lncRNA430945和pcDNA空白质粒的VSMCs行CCK8实验检测细胞增殖能力的变化,行划痕试验和Transwell迁移实验观察转染后VSMCs迁移能力的改变.同时我们利用血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)处理VSMCs12h使之处于相应的病理状态,设计并合成靶向沉默lncRNA430945的小干扰RNA(si-lncRNA 430945)和阴性对照(si-NC)转染VSMCs,并分组如下:分别建立阴性转染组(si-NC)、lncRNA430945干扰组(si-lncRNA 430945)、AngⅡ处理组(AngⅡ)和AngⅡ处理+lncRNA430945干扰组(AngⅡ+si-lncRNA430945).用CCK8实验来检测在0、12h、24h、36h、48h5个时间点处理后细胞的增殖情况,并绘制出生长曲线.对上述四组行划痕试验和Transwell迁移实验观察抑制lncRNA430945后AngⅡ诱导的VSMCs迁移能力的改变.最后,我们在VSMCs中转染pcDNA-lncRNA430945重组质粒过表达lncRNA430945,以及在VSMCs中转染特异性si-lncRNA430945敲低lncRNA430945的表达,分别行westernblot实验来观察当lncRNA430945表达变化后ROR2的表达情况.
结果:
1.过表达lncRNA430945促进VSMCs的增殖和迁移能力
行CCK8细胞增殖实验结果显示,相对于阴性对照组,细胞在转染pcDNA-lncRNA430945后,过表达lncRNA430945后VSMCs数量明显增加且呈现时间依赖性(24hP<0.05,36hP<0.01).说明lncRNA430945有促进VSMCs增殖的作用.划痕实验结果表明,与pcDNA组比较,pcDNA-lncRNA430945组划痕后24h的VSMCs迁移数显著增加(P<0.05).Transwell迁移实验结果显示:每个视野pcDNA-lncRNA430945组VSMCs穿过ECM胶的细胞数与pcDNA组比较明显增加(P<0.05).划痕实验和Transwell迁移实验结果说明转染pcDNA-lncRNA430945后的VSMCs迁移能力明显增强.
2.敲低lncRNA430945抑制AngII诱导的VSMCs的增殖和迁移
CCK8细胞增殖实验结果显示:与si-NC组相比,AngⅡ处理VSMCs后能够明显促进细胞的增殖(36hP<0.05,48hP<0.001);尽管si-lncRNA430945组VSMCs的增殖能力与si-NC组比较未见明显变化(P>0.05),但是在AngⅡ+si-lncRNA430945组中的实验结果发现,与si-NC组相比在36h内VSMCs的增殖能力无明显差异(P>0.05),而与AngⅡ组相比,VSMCs的增殖能力则明显减弱.这些结果表明敲低lncRNA430945在生理状态下对VSMCs增殖能力无明显影响,但是在病理性AngⅡ处理情况下,抑制lncRNA430945的表达能够显著抑制VSMCs的增殖活性.
划痕实验结果显示:敲低lncRNA430945后VSMCs迁移数明显低于si-NC组(P<0.05),AngⅡ处理后VSMCs迁移数明显增加(P<0.01),而在AngⅡ+si-lncRNA430945组中的VSMCs迁移数与si-NC组相比却无明显差异(P>0.05).Transwell迁移实验结果同样表明:敲低lncRNA430945后VSMCs穿过ECM胶的数量明显低于si-NC组(P<0.05),AngⅡ处理后的VSMCs穿过ECM胶的数量与si-NC组比较显著增多(P<0.01);而AngⅡ+si-lncRNA430945组中的VSMCs相对迁移数与si-NC组未见明显差别(P>0.05).划痕实验和Transwell迁移实验结果均说明在病理性AngⅡ处理情况下,抑制lncRNA430945的表达能够显著抑制VSMCs的迁移活性.
3.在VSMCs中lncRNA430945影响ROR2的表达
我们通过转染细胞pcDNA-lncRNA430945重组质粒来过表达lncRNA430945,westernblot实验证实过表达lncRNA430945后ROR2表达明显增加.随后进行小干扰RNA(si-lncRNA 430945)转染VSMCs,行westernblot实验证实敲低lncRNA430945后ROR2表达明显降低.这些结果表明,在VSMCs中lncRNA430945的表达变化可以影响ROR2的表达.
小结:LncRNA430945参与了VSMCs的增殖及迁移过程,同时lncRNA430945的表达变化可以影响ROR2的表达.
第三部分LncRNA430945对VSMCs增殖和迁移功能影响的相关机制研究
目的:探讨lncRNA430945及关联基因ROR2对VSMCs影响的相关机制,以便更好地认识AS的发生发展机制,并为其寻找有效的分子治疗靶点和预防策略提供新的实验证据.我们采用小鼠颈动脉结扎诱导内膜增厚增殖模型,进一步验证抑制lncRNA430945的表达对血管重构的保护作用,以期为确定lncRNA430945做为AS治疗的有效分子靶点提供实验依据.
方法:利用westernblot实验检测过表达或敲低lncRNA430945后RhoA信号GTP-RhoA的变化,以及增殖、迁移相关蛋白PCNA和MMP9的表达情况.
设计并合成靶向沉默小鼠ROR2(si-ROR2)的小干扰RNA和Negativecontrol(si-NC)转染VSMCs,行CCK8细胞增殖实验检测ROR2变化对VSMCs增殖情况的影响;我们进一步在VSMCs中过表达lncRNA430945和敲低ROR2的表达,实验分组如下:第一组转染pcDNA空白质粒(pcDNA);第二组转染pcDNA-lncRNA430945重组质粒(pcDNA-lnc RNA 430945)和第三组共转染过表达lncRNA430945质粒和特异性si-RNA(pcDNA-lncRNA430945+si-ROR2).相应对上述三组行CCK8细胞增殖实验检测细胞增殖能力的变化,行划痕试验、Transwell迁移实验观察各组VSMCs迁移能力的变化.
构建小鼠颈动脉结扎诱导内膜增厚增殖模型,采用F127胶和si-lncRNA430945原位敲低lncRNA430945表达后取材,行苏木精-伊红染色,与对照组相比观察血管内膜增生情况.行Westernblot实验检测组织中相关蛋白的表达情况.
结果:
1.在VSMCs中敲低或过表达lncRNA430945后,与si-NC或pcDNA组相比较,RhoA信号GTP-RhoA以及下游增殖、迁移相关蛋白PCNA、MMP9的表达明显降低或增加(P<0.05).
2.在小鼠VSMCs中特异性敲低ROR2或过表达lncRNA430945同时敲低ROR2表达后,CCK8检测结果显示,与si-NC转染的VSMCs组相比,si-ROR2转染后细胞增殖能力受到明显抑制(36hP<0.05,48hP<0.01);同样地,敲低ROR2后能够明显抑制过表达lncRNA430945对VSMCs增殖的促进作用.
划痕实验结果表明,与pcDNA组相比pcDNA-lncRNA430945组VSMCs迁移细胞数明显增加(P<0.01);而在pcDNA-lncRNA430945+si-ROR2组中VSMCs的迁移数目与pcDNA组相比无明显差异(P>0.05).与此相应的Transwell迁移实验结果显示,与pcDNA组相比pcDNA-lncRNA430945组每个视野VSMCs迁移数明显增加(P<0.01),而pcDNA-lncRNA430945+si-ROR2组与pcDNA组相比每个视野VSMCs迁移数无明显差异(P>0.05).划痕实验和Transwell迁移实验结果提示,敲低ROR2后能够明显抑制过表达lncRNA430945对VSMCs迁移的促进作用.
3.我们采用小鼠颈动脉结扎诱导内膜增厚增殖模型,给予原位敲低lncRNA430945后行HE染色结果显示,与si-NC处理组相比,si-lncRNA430945能有效抑制血管内膜增生.(P<0.05).
4.我们通过体内实验转染si-lncRNA430945来过敲低lncRNA430945,行westernblot实验提示RhoA信号GTP-RhoA以及下游增殖、迁移相关蛋白PCNA、MMP9的表达明显降低,表明GTP-RhoA、PCNA、MMP9的表达与lncRNA430945相关.
小结:LncRNA430945通过调节ROR2、RhoA信号通路中GTP-RhoA和PCNA、MMP9等相关蛋白的表达来进一步参与了VSMCs的增殖和迁移,沉默ROR2基因有望抑制lncRNA430945对VSMCs增殖和迁移的促进作用,对lncRNA430945、ROR2及RhoA信号通路的干预有望应用于AS的靶向治疗.
结论:
1.在人AS组织中VSMCs数目明显增多.在AS组织中有大量lncRNAs转录本产生并在AS病理中发挥重要作用.其是否可以作为临床AMI早期诊断的生物学标记物还需进一步研究.
2.LncRNA430945具有促进VSMCs增殖和迁移的生物学功能.
3.LncRNA430945是通过上调ROR2、RhoA信号GTP-RhoA以及下游增殖、迁移相关蛋白PCNA、MMP9的表达,促进VSMCs的增殖和迁移.对lncRNA430945、ROR2的干预有望应用于AS的靶向治疗.