BRIT1基因对肝癌细胞增殖与转移能力的影响及分子机制初探

来源 :泰山医学院 | 被引量 : 0次 | 上传用户:muyi_wang
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目的肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC,简称肝癌)是一种发生在肝脏中的目前临床上最常见的消化系统恶性肿瘤疾病之一。其恶性程度高,存活率低,术后转移仍是一个难以攻克的难题。BRIT1基因在DNA损伤应答和DNA修复信号通路中发挥着重要的作用,BRIT1基因作为一个十分重要的抑癌基因,我们推测其功能的缺失或者低表达都可能与癌症的发生和发展有着密不可分的联系,但迄今为止BRIT1在HCC中的表达和对HCC转移的影响尚未见报道。因此,研究BRIT1在HCC细胞中的表达和机制对于认识HCC的发生、发展和转移有着重要的理论意义,以期为抗HCC新药的开发和寻找一种新的判断HCC转移及其预后的分子标记提供科学依据。方法使用Western blot技术对13株常见的肝癌细胞株进行了蛋白水平的检测,以筛选出合适的相对低表达和高表达的HCC细胞株作为实验对象进行后续功能性研究。采用CCK-8法观察BRIT1过表达对HCC细胞增殖能力的影响;通过细胞划痕技术和Transwell技术,检测BRIT1过表达对HCC细胞迁移能力的影响;使用Matrigel包被的Transwell小室来模拟血管和淋巴管基底膜来观察BRIT1过表达对HCC细胞侵袭能力的影响;采用Western blot技术观察BRIT1蛋白与HCC中迁移相关蛋白SERPINA5的关系。设计合成目的基因BRIT1的RNA oligo,以RNAi negative control做对照,将第一部分筛选出的BRIT1表达水平最高的HCC细胞株进行瞬时转染,并寻找得到最佳的BRIT1沉默效果,来构建BRIT1沉默HCC细胞模型;利用CCK-8法、细胞划痕法、Transwell法以及Matrigel法,分别进行细胞生长曲线、细胞迁移和侵袭实验,对构建好的BRIT1沉默HCC细胞模型进行相应的增殖、迁移、侵袭等功能性研究;使用Western Blot对BRIT1蛋白和SERPINA5在HCC细胞转移中的作用和关系进行再次探索研究。使用Hep3B和BRIT1过表达Hep3B.BRIT1细胞构建尾静脉注射HCC细胞NOD/SCID小鼠体内转移模型,再通过进行体重观察、脏器系数计算、组织病理学分析,探讨BRIT1过表达对HCC细胞在NOD/SCID小鼠体内转移能力的影响。结果通过Western Blot检测确定了BRIT1相对低表达的Hep3B和高表达的SNU449细胞株,同时构建了BRIT1高表达的Hep3B.BRIT1细胞和BRIT1沉默的siSNU449细胞。相对于Hep3B细胞株,使用CCK-8法测得Hep3B和Hep3B.BRIT1细胞的生长曲线表明,Hep3B.BRIT1细胞增殖速度显著减弱(P<0.01);使用划痕法和Transwell法进行的迁移实验表明,Hep3B.BRIT1单侧细胞的迁移能力显著变弱,迁移数量显著减少(P<0.01);使用Matrigel法进行的侵袭实验表明,Hep3B.BRIT1细胞侵袭的细胞数量明显减少(P<0.05);Western Blot结果表明,Hep3B.BRIT1细胞中BRIT1蛋白表达水平显著提高后,SERPINA5蛋白也呈现出表达水平的显著上调(P<0.01)。通过蛋白水平检测得到了沉默效果最佳的RNAi条件是siRNA:LipoFiter=30pmol:1μl转染72 h,siSNU449肝癌细胞中BRIT1蛋白表达显著下调69%(P<0.01)。以SNU449细胞做对照,使用CCK-8法测得SNU449和siSNU449细胞的生长曲线表明,BRIT1沉默后siSNU449细胞增殖速度显著加快(P<0.01);使用划痕法和Transwell法进行的迁移实验表明,siSNU449单侧细胞迁移能力显著增加,迁移数量显著增多(P<0.01)。使用Matrigel法进行的侵袭实验表明,siSNU449细胞侵袭的细胞数量明显增加(P<0.05);Western Blot结果表明,siSNU449细胞中BRIT1的表达量明显下调60%以上后,SERPINA5蛋白在siSNU449细胞中也呈现出下调趋势,且有统计学差异(P<0.05)。通过构建NOD/SCID小鼠转移模型,发现Hep3B组有6只、Hep3B.BRIT1组有2只模型鼠在实验阶段内体重下降。对各组模型鼠进行解剖时发现Hep3B组有4只、Hep3B.BRIT1组有2只呈现出胃肠等内脏的异常黑色。分析脏器系数得到,Hep3B组和Hep3B.BRIT1组肝脏器系数均低于PBS对照组(P<0.01),Hep3B组的肺脏器系数略高于PBS对照组(P<0.05),而Hep3B.BRIT1组肝脏和肺的脏器系数相对于Hep3B组更接近于正常水平。病理形态学观察分析,Hep3B组有70%、Hep3B.BRIT1组有30%的模型鼠发生肺部转移。结论1.BRIT1基因与HCC细胞的增殖、迁移和侵袭能力有一定的关联,BRIT1过表达时,可以使HCC细胞的增殖、迁移和侵袭能力减弱;BRIT1基因沉默后,可以使HCC细胞的增殖、迁移和侵袭能力增强。2.BRIT1基因还可能通过调控SERPINA5蛋白的表达对HCC细胞的转移能力起到相应的作用,BRIT1表达上调时可以使SERPINA5表达也上调;BRIT1沉默后表达下调的同时可引起SERPINA5表达的下调。3.通过使用尾静脉注射的方式将BRIT1基因过表达的HCC细胞注射进NOD/SCID小鼠体内后,观察到BRIT1过表达会使NOD/SCID小鼠相关组织的病变程度减轻。
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