骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cell ,BMSC）是存在于骨髓中的除造血干细胞以外的另一类具有多向分化潜能的干细胞。具有贴壁生长的特性，在体外易分离和扩增，在一定的诱导条件下，这类细胞可定向分化为多种造血以外组织,特别是中胚层和神经外胚层来源的组织细胞，还易于外源基因的转入和表达，在人类医学上被认为是一种理想的治疗性细胞和基因治疗中的靶细胞。人骨形成蛋白2（ human bone morphogenetic protein 2，hBMP-2 ）属于转化生长因子β超家族中的一员，是最理想的诱骨因子，可以诱导未分化的骨髓间充质干细胞不可逆地分化为软骨细胞和成骨细胞,进而形成新骨的能力，当植入非骨组织时，能异位诱导成骨，在骨折和骨损伤修复过程中发挥着重要作用。BMP基因在生物进化过程中高度保守，种属间差异小，不同脊椎动物的BMP具有高度的同源性。 本研究基于细胞工程与转基因技术相结合，把诱骨因子hBMP-2基因整合到靶细胞BMSC中，再将BMSC植入骨损伤处，让hBMP-2基因在体内稳定地表达，从而达到hBMP-2基因基因治疗的目。所作的工作如下：1．采用密度梯度离心（Percoll分离液）法将BMSC从山羊骨髓血液中分离出来，置于低糖DMEM中进行传代培养。利用换液的方法对其纯化，接种两小时后开始贴壁，贴壁生长的细胞呈典型的成纤维细胞样外观。原代与传代培养细胞的生长曲线都为S型，但是传代培养的细胞生长速度比原代快。传代培养的结果显示，在经历了9代培养以后，山羊BMSC才出现衰老征象。与原代培养细胞的生长曲线相比，传代培养的细胞生长潜伏期短，每代只要9天就可铺满培养皿底壁。2．参考上皮细胞的冷冻方法，用含不同浓度的血清和DMSO的冷冻液进行冷冻，以解冻后的细胞贴壁率为标准，筛选理想的冷冻液。发现冻存液DMEM＋10％FBS+10%DMSO与DMEM+15%FBS+10%DMSO对山羊BMSC的冷冻有着相同的效果，因此选择DMEM+10%FBS+10%DMSO为山羊BMSC的冷冻液。3．取P1、P5和P9代细胞制备细胞爬片，用β-巯基乙醇/当归注射液分别对其进行定向诱导，每隔30min在光学显微镜下观察细胞形态变化，用免疫组织化学鉴定。结果表明β-巯基乙醇和当归注射液对山羊BMSC有同样的诱导效果，两种方法诱导后的细胞70%以上表达神经丝蛋白（NF）和神经元特异性烯醇化酶（NSE）。说明山羊BMSC同样可以被诱导成为神经样细胞，同时也说明了采用Percoll分离液进行梯度密度离心后分离的细胞为BMSC。4．采用TRIZOL法从人胎盘组织中提取总RNA，通过RT-PCR方法获得编码hBMP-2的基因，重组到pMD-18T载体上后在大肠杆菌中克隆，经检测，所获得的基因序列与基因文库中hBMP-2基因同源性为99.9%，即成功的克隆出了hBMP-2基因，为进一步研究hBMP-2基因在BMSC中的高效表达奠定了基础。 <WP=7>5．把目的基因从重组质粒上切下来，插入到荧光表达载体（pEGFP-C1）的多克隆位点，构建了hBMP-2基因融合GFP真核表达载体，并探讨了用脂质体转染的方法。为hBMP-2在BMSC内直接诱导作了准备，同时也为人类治疗许多骨科疾病提供了理想的动物模型。