休克为战创伤最常见的并发症,其发生率和死亡率都很高。严重创伤/休克病人广泛存在血管功能下降,主要包括两个方面:一是休克后血管反应性下降,即是全身血管对内源性和外源性血管舒缩物质反应性降低或是不反应。这种血管的低反应性严重影响休克的发生发展及治疗,是导致休克晚期血压难以回升和致死的主要原因之一。二是休克后血管屏障功能下降,即血管渗漏,也叫血管通透性升高,特别是创伤失血休克继发的严重脓毒症、脓毒性休克。血管渗漏可使血管内液体外渗,导致组织水肿和有效循环量的进一步下降,影响组织和器官功能,并最终发展为多器官功能障碍(MODS),其死亡率高达40-70%。目前研究证实血管低反应性的发生机制主要有:血管平滑肌细胞膜受体失敏机制、膜超极化及我们实验室提出的钙失敏学说。血管渗漏的机制主要包括两种途径:跨内皮细胞途径和内皮细胞旁途径。这两种途径在休克血管渗漏中发挥着主要作用,血管内皮生长因子(VEGF),凝血酶(thrombin),TNF-α等多种细胞因子主要也是通过这两条通路来影响血管的屏障功能。缝隙连接是一种细胞间的重要结构,在血管中呈现高表达,可介导细胞间多种电化学信号的传导,参与多种血管功能的调控。Cx43是细胞间缝隙连接的主要构成蛋白,研究发现Cx43在多种血管疾病中发挥重要的作用,如:动脉粥样硬化,高血压等。我们前期研究发现Cx43参与休克后血管反应性的调控,但其机制不清。最近有研究显示在酸吸入所导致的急性肺损伤中,Cx43的表达在肺血管的通透性变化中发挥重要作用,那么缝隙连接蛋白Cx43是否会参与在休克后血管渗漏的调节,机制如何?目前尚不清楚。研究已证实Rho激酶信号通路和PKC信号通路在调节细胞骨架、引起细胞收缩和细胞迁移等方面发挥关键的作用。我们前期的研究证实Rho激酶通路和PKC信号通路在休克后血管低反应性的调节中发挥重要的作用。另外也有研究发现在血管渗漏方面,Rho激酶通路也起着关键的作用,如Rho A/Rock通路介导了凝血酶引起的血管内皮通透性的增加。研究证实骨桥蛋白可作为一种信号分子参与与血管相关的多种病理生理变化的调节:如细胞粘附,血管生成和细胞迁移。例如OPN通过改变内皮屏障功能介导了由VEGF诱导的细胞迁移。此外,OPN可激活FAK和ERK信号通路,而这些信号通路可导致细胞的刚度变化和细胞骨架重排。这些生理和病理事件都提示OPN可能与血管内皮屏障功能有密切的关系,但具体的机制不清楚。那么Rho激酶通路和OPN是否参与休克后Cx43对血管渗漏和血管反应性的调节呢,尚不清楚。据此,我们首先利用严重脓毒症大鼠模型和体外LPS刺激肺静脉血管内皮细胞,研究了Cx43在严重脓毒症血管渗漏中的作用及其与Rho激酶,PKC和OPN的关系;第二,利用大鼠出血性休克模型,以及缺血缺氧处理的血管环和血管平滑肌细胞研究了Cx43在休克血管反应性调节中的作用及其与Rho激酶和PKC的关系。研究内容与方法:第一部分Cx43在调节严重脓毒症大鼠血管渗漏中的作用及机制。1.初步探讨Cx43在严重脓毒症血管渗漏中的作用:利用严重脓毒症大鼠及LPS刺激的肺静脉血管内皮细胞(VEC),观察血管渗漏情况和血管Cx43蛋白表达变化;利用慢病毒转染肺静脉血管内皮细胞,改变Cx43的表达,测定了单层VECs的TER和对荧光白蛋白(FITC-BSA)透过率的变化。2.Rho激酶在Cx43调节血管渗漏中的作用及机制研究:利用Cx43高表达和正常的肺静脉血管内皮细胞,观察Rho激酶抑制剂对Cx43调节休克血管渗漏的影响及Cx43对Rho激酶表达的影响。3.OPN/紧密连接蛋白在Cx43调节休克血管渗漏中的作用及机制研究:利用严重脓毒症大鼠和LPS刺激的肺静脉血管内皮细胞,测定OPN,zo-1,claudin-5表达变化及血管渗漏的变化,及OPN的RNA干扰对血管渗漏及zo-1和claudin-5表达的影响;及利用Cx43转染的肺静脉血管内皮细胞,观察Cx43对OPN表达的影响及Cx43对OPN上游转录因子表达的影响。第二部分Cx43在调节失血性休克大鼠血管低反应性中的作用及机制。1.Cx43在PDGF调节血管反应性中的作用及与PKC和Rho激酶的关系:利用失血性休克大鼠及缺氧血管环,观察MEGJ阻断剂和Cx43AODN对休克血管钙敏感性和反应性的影响;利用血管平滑肌细胞,观察了Rho激酶和PKC的抑制剂在PDGF调节血管反应性中的作用,及Cx43AODN在PDGF调节Rho激酶和PKC活性中的作用。2.Cx43在BK调节血管反应性中的作用及机制:利用失血性休克大鼠缺氧处理的血管环,观察MEGJ阻断剂18α-GA对血管反应性的影响,及Rho激酶和PKC抑制剂在Cx43介导BK调节休克血管反应性中的作用及机制。实验结果第一部分Cx43对严重脓毒症血管渗漏的调节作用及机制(一)Cx43在严重脓毒症血管渗漏中的作用Cx43参与了严重脓毒症血管血管渗漏的发生,Cx43表达变化与通透性变化呈正相关,改变Cx43的表达可显著调节血管渗漏。提示Cx43在严重脓毒症血管渗漏中发挥重要的作用。(二)Rho激酶-MLC20在Cx43调节血管渗漏中的作用及机制研究LPS刺激和Cx43高表达可显著升高白蛋白的透过率和降低TER值,改变内皮细胞应激纤维的形态,使细胞呈现向中心收缩。Rho激酶抑制剂Y-27632可减轻透过率的升高和TER值的降低及抑制细胞向心收缩。LPS刺激和Cx43高表达可显著性升高Rho激酶的表达,Cx43RNAi可降低了Rho激酶的表达。LPS刺激和Cx43高表达可显著升高的MLC20的磷酸化水平,Rho激酶抑制剂可抑制MLC20磷酸化升高。Cx43的高表达可上调Rho激酶蛋白表达水平。提示Rho激酶-MLC20通路参与了Cx43对休克血管渗漏的调节(三)OPN/紧密连接蛋白在Cx43调节血管渗漏中的作用及机制研究严重脓毒症大鼠和LPS刺激内皮细胞后,OPN的表达显著升高,zo-1和claudin-5的表达逐渐降低。Cx43高表达显著性地降低了zo-1和claudin-5的表达。Cx43干扰对zo-1和claudin-5的表达没影响,但能阻止LPS刺激引起的zo-1和claudin-5表达的下降。OPN干扰可抑制Cx43对zo-1和claudin-5表达的下调。提示,OPN介导了Cx43对休克血管渗漏的调节。Cx43高表达显著性地升高了Tcf-4和β-catenin的m RNA水平及上调了OPN的表达,β-catenin和Tcf-4的RNA干扰可抑制Cx43对OPN表达的上调。证实了Cx43对OPN的调节是通过转录因子Tcf-4/β-catenin来实现的。第二部分Cx43调节失血性休克大鼠血管反应性及其机制(一)Cx43介导PDGF调节血管反应性及与PKC和Rho激酶的关系PDGF可明显改善休克后血管的反应性,MEGJ的阻断剂18-GA和Cx43AODN抑制了PDGF对休克血管反应性的改善作用。PKC抑制剂和Rho激酶抑制剂可显著抑制PDGF对休克血管反应性和钙敏感性的的改善作用。PDGF可明显升高缺氧血管中Rho激酶底物MYPT和PKC底物Peptag C1的磷酸化,Cx43AODN明显抑制了PDGF对缺氧血管MYPT和Peptag C1的磷酸化改善作用。提示Cx43通过激活PKC和Rho激酶通路,介导了PDGF对休克血管反应性的调节。(二)Cx43在BK调节血管反应性中的作用及机制BK显著改善休克后血管的反应性,MEGJ阻断剂18-GA和Cx43AODN显著性的降低了血管对BK的反应性。BK可磷酸化Cx43的ser368位点及激活Rho激酶,PKC-α和PKC-ε的活性,BK对休克血管的改善作用可被Rho激酶抑制剂和PKC抑制剂所阻断。PKC和Rho激酶的激动剂可改善休克血管对BK的反应性,这种作用可被Cx43AODN所阻断。提示,Cx43通过其ser368位点磷酸化和PKC,Rho激酶通路,参与了BK对休克血管反应性的调节。结论1.Cx43参与了休克后血管通透性的调节,一方面Cx43通过激活Rock1-MLC20通路,使细胞骨架发生改变,细胞出现向心收缩,增大内皮细胞间的缝隙;另一方面,Cx43通过转录因子Tcf-4/β-catenin通路,上调OPN的表达。OPN表达的上调会抑制紧密连接蛋白zo-1和claudin-5的表达,使细胞间紧密连接减少,增大通透性。2.Cx43参与了PDGF和BK对休克血管反应性的调节,通过磷酸化Cx43的ser368位点,调节Rho激酶和PKC的活性,改善休克血管的钙敏感性和反应性。