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本研究以中国原产完全甜柿‘小果甜柿’(C-PCNA)为试材,以非完全甜柿(non-PCNA)和日本原产完全甜柿(J-PCNA)为对照,首先采用同源克隆法获得柿单宁聚合相关的关键酶(漆酶)基因及其基因家族cDNA片段并获得相应cDNA全长;进而通过分析其在不同脱涩类型、不同发育阶段、不同组织部位的表达模式差异,结合单宁成分和含量分析,筛选与中国原产完全甜柿单宁聚合直接相关的目标基因；通过构建拟南芥转基因载体和原生质体定位载体分别转化拟南芥tt10突变体和拟南芥叶肉原生质体进一步确认其功能和基因定位；接着克隆该目标基因的启动子序列,通过生物信息学分析,预测该目标基因是否受公认的PA合成途径中转录因子(MYB、MYC、WRKY等)的调节；最后期望基于上述结果和技术,初步建立起完全甜柿遗传改良的分子育种技术体系。从而为进一步阐明中国原产完全甜柿自然脱涩特点,以及选育具自主知识产权的完全甜柿新品种奠定基因资源和技术基础。主要研究结果如下:
1、柿单宁细胞发育模式:中国原产完全甜柿(C-PCNA)单宁细胞在果实发育早期单宁细胞较小,最大面积小于30×103μm2。单宁细胞内单宁物质积累持续到果实发育中后期,但在果实发育后期其果实仍能自然脱涩,在果实发育整个过程中伴随着可溶性单宁向不溶性单宁的聚合转化,且在果实发育中后期转化尤为明显。说明我国原产完全甜柿单宁细胞发育介于日本原产完全甜柿(J—PCNA)和非完全甜柿(non-PCNA)之间,且存在可溶性单宁向不溶性单宁聚合转化现象。
2、DkLAC1基因克隆及表达分析:从‘小果甜柿’(Diospyros kaki Thunb.‘Xiaoguo-tianshi’,C-PCNA)幼果中扩增出长1794 bp包含ORF的漆酶(Laccase,LAC)基因cDNA全长序列,编码569个氨基酸残基,命名为DkLAC1。该序列有LAC蛋白所特有的铜离子结合位点和His-rich保守序列。DkLAC1表达水平变化趋势与我国原产完全甜柿单宁积累趋势相一致。
3、DkLAC1启动子克隆分析:得到DkLAC1启动子序列1789bp,生物信息学分析发现该区域不仅具有TATA-BOX、CAAT-BOX等启动子区域普遍存在的顺式作用元件,同时DkLAC1基因启动子区域还具有多个原花青素生物合成途径中转录因子的结合位点,如MYBCORE、MYC-BOX和W-BOX等调控单宁生物合成基因的作用元件。表明柿漆酶基因DkLAC1在柿单宁合成途径中受MYB等转录因子调控。
4、柿单宁转运相关基因DkGST克隆分析:从柿EST数据库中搜索到一条GST基因全长,在起始密码子和终止密码子上下游分别设计引物,以C-PCNA和J-PCNA为模板扩增,得到两个不同转录本,且在不同类型果实中表达模式存在差异。柿单宁合成途径中其它基因DkLMR和DkMYB存在同样的现象。推测C-PCNA脱涩机理不同于J-PCNA,可能是由于单宁生物合成途径中不同类型果实所含的关键结构基因或转录因子的转录本存在差异或不同转录本表达丰度不同所致。
5、遗传转化及原生质体定位分析:将带有DkLAC1基因的载体转入tt10突变体中,转基因植株能够部分恢复或完全恢复野生型表型,说明DkLAC1能与拟南芥AtLMC15/TT10功能互补,证实DkLAC1参与PA单体的聚合过程。本实验进行了原生质体瞬时表达定位分析,其结果与PSORT生物信息学预测的结果相符,即该基因可能定位于液泡或质外体。