非酒精性脂肪性肝病（Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD）是指除酒精等明确肝损伤因素外其他因素所导致的代谢应激性肝损伤,即在不过量饮酒的基础上,脂肪在肝中大量累积并产生病变。NAFLD是一种常见的肝脏病理改变,被公认为是世界上最常见的肝脏疾病,影响了全球25%～30%的人群,且发病率在不断升高,发病年龄日趋年轻化。2018年,我国NAFLD患病率达到32.9%,成为我国慢性肝病的首要原因。NAFLD病理机制复杂,西药尚无有效药物及治疗手段,到目前为止,还未有美国食品与药品监督管理局（FDA）批准为治疗NAFLD的临床药物,治疗中心也仅仅围绕着行为矫正、饮食、锻炼和减肥等来逆转NAFLD。近年来,随着国家中医药大健康产业的发展,中医药在证候规律研究及辨证治疗NAFLD方面取得了一定的进展,对NAFLD的治疗卓有成效且手段多样,可能为NAFLD的治疗提供新的思路。如:虎杖苷、大黄素、姜黄素、灵芝三萜等单味药物均具有显著的药理疗效。延胡索（Corydalis yanhusuo W.T.Wang）作为我国最常用的传统中药之一,在神经系统、心血管系统及内分泌系统方面具有良好的药理作用。延胡索乙素（Levo-tetrahydropalmatine,THP）是中药延胡索中的主要成分之一,属于生物碱类化合物,为临床常用药,其药效学研究主要集中在镇痛、镇静、催眠等方面,常用于治疗中枢神经系统相关的疾病,但目前对肝脏疾病的研究却鲜有报道,相关系统研究亟待进行。目的:本课题旨在靶向基于AMPK的非酒精性脂肪性肝病的关键调控信号通路,为阐明延胡索乙素“如何调控脂质代谢与激活氧化应激”、“如何评价治疗非酒精性脂肪性肝病的有效性和安全性”等科学问题开展研究,为NAFLD治疗提供新的思路及策略。方法:采用油酸和棕榈酸联合诱导的方法,建立一种体外非酒精性脂肪性肝病细胞模型的方法,同时创建更全面的培养基成分,综合形成营养过剩微环境,使细胞模型脂肪变性程度更高,达到建立一种接近于临床的、体积增大且数量增多的非酒精性脂肪性肝病细胞模型;采用合理药物筛选策略,选择药效好、安全性强的中药单体化合物延胡索乙素,通过不同的非酒精性脂肪性肝病细胞模型,研究药物分子对模型细胞的活性、克隆形成等细胞毒性作用;采用x CELLigence实时无标记细胞分析筛选药物作用非酒精性脂肪性肝病细胞模型的适宜浓度,明确药物分子对非酒精性脂肪性肝病细胞模型的降脂活性和安全性;探索药物分子在调控非酒精性脂肪性肝病m RNA中发挥改善脂质蓄积的基因作用机制;通过Western blot检测相关脂质合成及脂质氧化过程中关键蛋白的表达水平变化,阐明基于AMPK调控相关脂代谢及氧化的通路网络;利用不同药物ATP合酶抑制剂、解偶联剂FCCP、呼吸链抑制剂Rotenone/Antimycin A、葡萄糖及糖酵解抑制剂2-DG刺激不同的非酒精性脂肪性肝病细胞模型,明确药物分子影响非酒精性脂肪性肝病细胞模型的氧化磷酸化和糖酵解能力,揭示药物分子对NAFLD细胞模型的能量作用机制;动物模型建立及分组:32只6周龄SPF级C57BL/6雄性小鼠适应性喂养7天后,随机分为空白对照组,模型组,延胡索乙素40 mg/kg组,延胡索乙素80 mg/kg组,每组8只;空白对照组给予普通饲料喂养,其余3组以高脂高糖饲料喂养12周,建立非酒精性脂肪性肝病动物模型,利用高脂小鼠模型来明确药物分子治疗非酒精性脂肪性肝病的有效性,并通过生化指标、生命指标数据分析,完成药理学、毒理学等临床前评价,探索延胡索乙素在动物模型中的成药性评估和药理学机制;采用代谢组学方法,检测并筛选出非酒精性脂肪性肝病发生和发展过程中具有重要生物学意义和统计学显著差异的代谢物,为非酒精性脂肪性肝病的诊断和治疗提供重要策略。结果:采用油酸和棕榈酸可形成游离脂肪酸联合诱导的方法,通过油红O染色可显示脂滴,说明成功建立SMMC-7721细胞和BEL-7402细胞体外细胞脂肪蓄积模型,并确定了在SMMC-7721细胞中1000μM油酸钠与500μM棕榈酸钠（2:1）时,细胞脂肪变模型最优,在BEL-7402细胞中400μM油酸钠与200μM棕榈酸钠（2:1）时,细胞脂肪变模型最优。基于体外改善脂质堆积模型的建立,筛选出具有效果显著且安全性高的延胡索乙素浓度,分别在SMMC-7721细胞和BEL-7402细胞的浓度为:75、100μM和50、75μM,可用于后续试验。通过细胞克隆形成、x CELLigence实时无标记技术等进一步验证了已筛选出的药物延胡索乙素浓度具有高保护、低毒性的效果,可减少对脂肪变性细胞模型的损伤。荧光定量PCR结果显示,在药物分子作用脂肪变性模型中,参与细胞内脂质代谢、糖代谢相关转录因子,其中包括AMPK、ACC、FAS、HMGCR、SREBP-1c、TBC1D1、PGC-1α及CPT-1等,与模型组相比延胡索乙素干预组均出现显著性生理变化,且相关脂质及糖代谢基因表达均受到不同程度调控。Western blot结果显示,与空白对照组相比,模型组脂肪变性细胞SREBP-1c、FAS蛋白均表达水平上升;与模型组相比,延胡索乙素干预组SREBP-1c、FAS蛋白表达水平下降;与空白对照组相比,模型组脂肪变性细胞p-AMPK、SIRT1、p-ACC蛋白均表达水平下降;与模型组相比,延胡索乙素干预组p-AMPK、SIRT1、p-ACC蛋白表达水平下降。肝脏中脂质的病理积累是由于脂质生成或摄取与脂质的线粒体氧化分解代谢之间的不平衡造成的,为进一步验证药物干预后线粒体代谢变化,用耗氧量（OCR）与胞外产酸能力（ECAR）表示;在脂肪变性细胞中,检测OCR显示,基础呼吸、ATP产量和最大呼吸能力均被促进,检测ECAR显示,糖酵解和糖酵解能力被抑制,结果表明延胡索乙素促进体内引发氧化应激的活性,进一步提高脂质氧化所需提供的能量,同时在此过程中验证了延胡索乙素发挥促进OCR和抑制ECAR的作用依赖AMPK激活。体内动物实验结果显示,经过延胡索乙素治疗可以降低NAFLD模型小鼠的体重及肝重;血液生化分析显示,延胡索乙素能有效地降低血液中甘油三酯、总胆固醇和低密度脂蛋水平,并提高高密度脂蛋白水平,血浆血脂指标明显改善;肝脏组织蛋白表达结果显示,延胡索乙素可促进AMPK和ACC的磷酸化并提高SIRT1水平,进一步促进脂肪酸氧化,抑制FAS和SREBP-1c的活性,从而抑制脂肪合成;肝脏免疫组织化学也进一步验证了FAS的变化差异;肝脏组织病理切片显示延胡索乙素治疗后肝细胞由伴有大泡性脂肪变性、炎症细胞浸润改善为排列较整齐、脂质沉积和脂肪变性明显减少,心、肺、肾和脾等病理切片显示延胡素乙素未造成显著性的病理损伤。基于广泛靶向技术进行全谱代谢组检测,获得全面的代谢组信息,研究了动物模型中模型组和延胡索乙素治疗组之间的代谢组差异,共检测到1371个代谢物,主要包括甘油脂类、甘油磷脂类、脂肪酰类、甾醇脂类、鞘脂类等,并筛选出8个差异代谢物;通过PCA、OPLS-DA/S-Plot、VIP图、条形图、差异代谢物聚类热图、差异代谢物KGGG富集等分析,以阐明非酒精性脂肪性肝病的代谢过程和变化机制。结论:在游离脂肪酸诱导的SMMC-7721、BEL-7402细胞变性模型和高脂高糖喂养的C57BL/6小鼠模型中,延胡索乙素可改变AMPK活性,并通过调控SREBP-1c/FAS通路及增强SIRT1蛋白活性,有效地缓解了过度的氧化应激和肝细胞内过度的脂肪蓄积,进一步抑制脂质合成并促进脂肪氧化分解,最终改善非酒精性脂肪性肝病。